Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के जीनोम संपादन मानव विकास को समझते हैं और बीमारी के pathophysiology की जांच के लिए एक आनुवंशिक रूप से नियंत्रित और चिकित्सकीय प्रासंगिक मंच प्रदान करता है। जीनोम संपादन के लिए साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ (SSNs) का काम करके, एक अन्यथा isogenic सेटिंग में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन को शरण देने के लिए नए hPSC लाइनों के तेजी से व्युत्पत्ति संभव हो जाता है। जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / Cas9 सबसे अधिक इस्तेमाल किया SSNs हैं। इन न्युक्लिअसिज़ के सभी जिससे एक जीनोमिक ठिकाना पर सटीक जीन संपादन को बढ़ावा देने, एक निर्दिष्ट स्थल पर एक डबल असहाय डीएनए को तोड़ने को शुरू करने से कार्य करते हैं। एसएसएन-तप जीनोम संपादन प्रविष्टि / विलोपन म्यूटेशन या Alt लागू करने के लिए या तो सेल की अंतर्जात डीएनए की मरम्मत तंत्र, गैर मुताबिक़ अंत (NHEJ) में शामिल होने और अनुरूपता निर्देशित मरम्मत के दो (एचडीआर), कारनामेडबल असहाय तोड़ने के स्थल पर एक मुताबिक़ मरम्मत टेम्पलेट का उपयोग कर जीनोम इंजी। HPSCs के electroporation जैसे फ्लोरोसेंट पत्रकारों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट के रूप में ट्रांसजीन शामिल है कि SSNs और मरम्मत टेम्पलेट्स transfecting का एक कारगर साधन है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, यह एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए चयन करके मरम्मत का निर्माण शामिल है कि केवल उन hPSCs अलग करना संभव है। यंत्रवत् hPSC कालोनियों को अलग करने और जीनोटाइपिंग के माध्यम से लक्ष्य साइट पर उचित एकीकरण की पुष्टि के लिए सही ढंग से निशाना बनाया और आनुवंशिक रूप से सजातीय सेल लाइनों के अलगाव के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल की वैधता EGFP और एक puromycin प्रतिरोध मानव स्टेम कोशिकाओं में AAVS1 सुरक्षित बंदरगाह लोकस में निर्माण शामिल करने के लिए सभी तीन एसएसएन प्लेटफार्मों का उपयोग करके यहाँ प्रदर्शन किया है।
जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों तेजी से आणविक और कोशिका जीव विज्ञान 1 के लिए मानक उपकरण में विकसित हो रहे हैं। HPSCs आनुवंशिक रूप से बरकरार प्राथमिक मानव कोशिकाओं की एक स्वयं renewing स्रोत का प्रतिनिधित्व के रूप में मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) की जेनेटिक इंजीनियरिंग विशेष रुचि का है। hPSCs रोग मॉडलिंग के लिए या प्रत्यारोपण उपचारों 2,3 के लिए एक स्रोत के रूप में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सकता है। AAVS1 ठिकाना पर एक संवाददाता का निर्माण के लक्षित एकीकरण के लिए अंतर्जात डीएनए की मरम्मत तंत्र के साथ संयोजन के रूप में साइट विशेष न्युक्लिअसिज़ (SSNs) के तीन विभिन्न प्रकार इस्तेमाल करता है कि एक प्रोटोकॉल यहाँ है का प्रदर्शन किया। HPSCs में SSNs की अभिकर्मक के बाद, हम रिपोर्टर को शरण देने isogenic सेल आबादी को अलग करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है।
विशेष रूप से pluripotent सेल जीनोम स्टेम, जीनोम हेरफेर करने की क्षमता का उपयोग, SSNs जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs) और प्रतिलेखन activat की उपयोगिता के रूप में एक नई घटना नहीं हैजीन संपादन के लिए या की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) कई साल पहले 4-10 प्रदर्शन किया गया। हालांकि, एस pyogenes CRISPR के आगमन / Cas9 प्रौद्योगिकी 11-13 से, जीन संपादन 14 व्यापक रूप से सुलभ हो गया है। सभी SSNs गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) या अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) 15 या तो उपयोग कर अंतर्जात सेलुलर तंत्र द्वारा मरम्मत की है कि निर्दिष्ट लक्ष्य साइट 1,4,5,11 में एक डबल असहाय डीएनए तोड़ (डीएसबी) परिचय। NHEJ त्रुटि प्रवण है और उपन्यास तत्वों एसएसएन के साथ एक मरम्मत टेम्पलेट के सह अभिकर्मक के माध्यम से पेश किए जाने के लिए एचडीआर की अनुमति देता है, जबकि जीन समारोह के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप फ्रेम पारी म्यूटेशन लागू कर सकते हैं। जीन संपादन की सुविधा है कि डीएनए की मरम्मत के सिद्धांतों प्रत्येक एसएसएन के लिए काफी हद तक ही माना जाता है, वहीं प्लेटफार्मों के बीच कुछ मतभेद का उल्लेख किया जा सकता है। डी ZFNs की नोवो डिजाइन लचीलापन और nuclease अनुकूलन 16, सार्वजनिक रूप से हालांकि उपयोग की अनुमति देता हैव्यक्तिगत ZFNs डिजाइन करने के लिए उपलब्ध विधानसभा पुस्तकालयों और स्क्रीनिंग उपकरण समय लगता हो सकता है। ZFN की मध्यस्थता लक्ष्य-निर्धारण के लिए वांछित ठिकाना चुना गया है, एक बार ZFN जोड़े ऑनलाइन उपकरण ZiFit 17 के साथ बनाया जा सकता है। डिजाइन के बाद, ZFNs modularly प्लाज्मिड क्लोनिंग 18 के कई दौर के माध्यम से इकट्ठा किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, पूर्व मान्य ZFNs 19 देखते हैं। कहानी न्युक्लिअसिज़ भी ऑनलाइन उपकरण और सार्वजनिक रूप से उपलब्ध घटकों 17,20 का उपयोग कर बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, TALENS तेजी से फ्लैश विधानसभा 21 या पीसीआर आधारित श्रेणीबद्ध गोल्डन गेट विधानसभा में 22 का उपयोग कर के माध्यम से, पांच कहानी दोहराता के ब्लॉक से इकट्ठा किया जा सकता है। एसएसएन डिजाइन और CRISPR / Cas9 का उपयोग करते हुए निर्माण की गति की आसानी के लिए एक व्यापक रूप से सुलभ उपकरण संपादन जीनोम बना दिया है। गाइड RNAs के बहुसंकेतन एक भी निर्माण 14 के साथ कई स्थलों को निशाना बनाने की लिए CRISPR के छोटे से मार्गदर्शन आरएनए की मध्यस्थता लक्ष्य-निर्धारण / Cas9 भी अनुमति देता है। परिरूपलक्ष्य ठिकाना को समीपस्थ; जीन संपादन के लिए Cas9 की एक protospacer आसन्न मूल भाव (एस के लिए एक NGG trinucleotide Cas9 pyrogenes पीएएम) की ही पहचान की आवश्यकता है। Px330 प्लाज्मिड 14 में पाम के 20 आधार जोड़े 5 'के लिए इसी oligonucleotide डालने से, निर्माण एक क्लोनिंग कदम में इकट्ठा किया जा सकता है। एस के अलावा pyogenes Cas9, एन से Cas9 एक 5'-NNNNGATT-3 '(पीएएम) को पहचानता है कि meningitidis (NmCas9) hPSCs 23 में कुशल जीन-संपादन के लिए अनुमति देने के लिए दिखाया गया है।
एसएसएन डिजाइन के आराम में अंतर करने के लिए इसके अलावा, प्रत्येक मंच विशिष्ट गुण है। उदाहरण के लिए, ZFNs और TALENS Cas9 ज्यादातर उत्पन्न एंडेड DSBs कुंद करने के लिए सोचा है, जबकि एक चार न्यूक्लियोटाइड 5 'की अधिकता 24 उत्पन्न करता है जो FokI nuclease डोमेन, का उपयोग। ZFNs, TALENS, और Cas9, पर बंद दर लक्ष्य डीएनए पर, उनके प्रोटीन stabilities में मतभेद है, और डीएनए स्कैनिंग की विधा है, जो सभी ग कीसैद्धांतिक रूप से संपादन परिणाम 1 में छोटे मतभेदों में परिणाम ould। आगे की पढ़ाई पूरी तरह से इन मतभेदों के परिणामों को समझने के लिए आवश्यक हो जाएगा, वहीं हम यहाँ सभी तीन प्लेटफार्मों भर में बेहद मजबूत है और आसानी से आनुवंशिक रूप से संशोधित hPSCs उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
भले ही एसएसएन पसंद का, इलेक्ट्रोपोरेशन hPSCs 25 में SSNs और अनुरूपता मरम्मत टेम्पलेट्स transfect करने के लिए एक मजबूत प्रक्रिया है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध के लिए चयन के बाद कालोनियों जीवित रहने की संख्या ठिकाना विशिष्ट मानकों और संपादन रणनीति (ट्रांसजेनिक डालने और चयन के मोड के जैसे, आकार) पर निर्भर करता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बारे में आमतौर पर 150-400 एकल कोशिका ली गई कालोनियों में यह परिणाम है।
जीन-संपादन इस प्रोटोकॉल का उपयोग AAVS1 ठिकाना पर पहले से SSNs 4,5 के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एएवी-CAGGS-EGFP मरम्मत टेम्पलेट एक जीन जाल एसटीआर का उपयोग करता हैategy एक ठिकाना विशिष्ट ढंग से puromycin प्रतिरोध प्रदान करने के लिए। संक्षेप में, मरम्मत टेम्पलेट promoterless puromycin प्रतिरोध कैसेट के अपस्ट्रीम एक ब्याह स्वीकर्ता साइट में शामिल है। AAVS1 ठिकाना पर PPP1R12C जीन की पहली Intron में सही एकीकरण पर, प्रतिरोध कैसेट संपादित जीन के प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है। इस विशिष्ट AAVS1 परख की मजबूती हमें प्रत्येक एसएसएन मंच की क्षमता की तुलना करने के लिए अनुमति देता है।
SSNs का उपयोग जीन संपादन बाधित और / या सैद्धांतिक रूप से किसी भी जीन में परिवर्तन करने की क्षमता को देखते हुए शक्तिशाली है। HPSCs के लिए इस रणनीति को लागू करने hPSCs बाद में इस तरह के न्यूरॉन्स 26 के रूप में मानव कोशिका प्रकार की एक भीड़ में भेदभाव किया जा सकता है, बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है 27 Hepatocytes, और 28 cardiomyocytes। इसके अतिरिक्त, रोगी व्युत्पन्न प्रेरित स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के एक रोगी विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि 29 में मरम्मत या ज्ञात रोग के कारण म्यूटेशन की शुरूआत की अनुमति देता है </sup>, रोग तंत्र और एक मरीज की अपनी कोशिकाओं को 30 का उपयोग परीक्षण चिकित्सा जांच के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। सारांश में, hPSCs में जीन संपादन मानव विकास और बीमारी 31 के मूल जीव विज्ञान की जांच के लिए एक कुशल और बहुमुखी दृष्टिकोण है।
जीन-सम्पादित मानव स्टेम कोशिकाओं के समरूप आबादी को अलग-थलग करने के लिए यहाँ प्रस्तुत विधि लक्षित ठिकाना पर ही मतभेद है कि isogenic hPSC लाइनों पैदा करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। इन कोशिकाओं को मानव सेलुलर भेदभाव और विकास के तंत्र की जांच के लिए और साथ ही एक नियंत्रित आनुवंशिक सेटिंग में monogenic रोगों के pathophysiology को समझने के लिए एक आदर्श व्यवस्था कर रहे हैं। यहां प्रदर्शन के रूप में, यह AAVS1 ठिकाना पर लक्षित एकीकरण को प्राप्त करने के लिए तीन स्वतंत्र एसएसएन डिजाइन रणनीतियों (ZFNs, TALENS, और CRISPR / Cas9) का उपयोग करने के लिए संभव है। इन तरीकों में से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान है। एक संभावित ZFNs का लाभ और, कुछ हद तक, TALENS व्यक्ति न्युक्लिअसिज़ 42 के डोमेन बाध्यकारी डीएनए में सुधार के क्रम में चलने का इंजीनियरिंग की अनुमति देता है जो उनके डिजाइन लचीलापन है। इस nuclease अनुकूलन सीआरआई के साथ प्राप्त है क्या परे ZFNs और TALENS की विशिष्टता को बढ़ा सकता हैएसपीआर / Cas9 प्रणाली। इस तरह के चयनात्मकता लक्ष्य विशिष्टता के एक उच्च स्तर की आवश्यकता नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली के प्राथमिक लाभ प्रयोग के अपने आसानी है। TALEN और ZFN निर्माण किट (Addgene 21 के माध्यम से, यानी) जनता के लिए उपलब्ध कराया गया है हालांकि केवल आवश्यक अनुकूलन एक 20 आधार जोड़ी oligonucleotide है के रूप में px330 प्लाज्मिड का उपयोग करते समय, CRISPR / Cas9 आधारित SSNs (, के निर्माण के लिए काफी आसान कर रहे हैं डिजाइन 14)। इस सादगी को उनकी पढ़ाई में जीनोम संपादन में शामिल करने के लिए देख अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए फायदेमंद साबित होता है।
जीन-सम्पादित hPSC लाइनें बनाने के लिए nucleofection के 43, सहित वैकल्पिक अभिकर्मक तकनीक, कर रहे हैं; हालांकि इलेक्ट्रोपोरेशन सुसंगत और लागत प्रभावी 4,5,25 होना दिखाया गया है। Nucleofection एसएसएन दक्षता एक बढ़ती हुई, सीधे नाभिक में Cas9-गाइड आरएनए ribonucleoprotein परिसरों transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताडी निष्ठा 44। MEFs पर hPSCs बढ़ रहा अत्यधिक भेदभाव के बिना एक pluripotent राज्य में hPSCs बनाए रखने के लिए एक मजबूत और सस्ता तरीका है। इसके अलावा, यह आनुवंशिक रूप से समान कालोनियों के आसान अलगाव के लिए अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, यह हालांकि इन संस्कृति की स्थिति फीडर आधारित संस्कृतियों की तुलना में अधिक महंगा हो सकता है, MEFs बिना संस्कृति hPSCs के लिए संभव है। इसके अलावा, पूरी प्रक्रिया बहुत ही दुर्लभ संपादन घटनाओं के अलगाव या समानांतर संपादन प्रयोगों में कई अलग सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, स्केलेबल है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मजबूत है; हालांकि सही ढंग से संपादित क्लोन प्राप्त किया जा सकता है, जिसके साथ दक्षता को प्रभावित करने वाले कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। इस विधि के लिए सबसे महत्वपूर्ण घटक उच्च गुणवत्ता MEFs और दवा प्रतिरोधी DR4 MEFs हो रही है। एकल hPSCs के अस्तित्व कमजोर है, और कम गुणवत्ता MEFs अविभाजित hPSC लाइनों के अलगाव को रोकना होगा। दूसरा, वाई 27,632 का उपयोग भी हैएक असामान्य कुपोषण 45 के साथ कोशिकाओं के लिए एक चयनात्मक दबाव पैदा करने के बिना एक सेल अस्तित्व की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है। तीसरा, अच्छी तरह से स्थान कालोनियों उठा ली गई कोशिका लाइनों के आनुवंशिक एकरूपता सुनिश्चित करता है। अंत में, यह उद्घाटन कई छोटे टुकड़ों में कॉलोनी को तोड़ने के लिए काफी छोटा है तो यह है कि कई कालोनियों नए तरह में विकसित होगा सुनिश्चित करना है कि कांच pipettes तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक प्रतिकृति प्लेट जीनोटाइपिंग के लिए पृथक कालोनियों के मूल प्लेट छोड़ रहा है, संस्कृति में है करने के लिए यह अच्छी तरह से स्थान subclones की उठा परमिट। इस प्रोटोकॉल में एक चुनौतीपूर्ण हिस्सा कांच pipettes की खींच मैनुअल है; यह पहले अभ्यास किया जाना चाहिए। यह एक गिलास पिपेट की आवश्यकता नहीं है कि क्लोन उठा के कई तकनीकों हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रयोगकर्ता उनके लिए सबसे अच्छा काम करता है कि एक खोजने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है।
सरल संशोधनों के द्वारा दूर किया जा सकता है कि इस प्रोटोकॉल के लिए सीमाएं हैं। ओ करने के उद्देश्य से एक प्रयोगnly जिनकी मरम्मत टेम्पलेट एक चयन कैसेट शामिल नहीं है, संपादित किया गया है कि कोशिकाओं के लिए समृद्ध बनाने का एक और तरीका का उपयोग करना चाहिए की मरम्मत या एक के बिना ब्याज का ठिकाना बाधित। एक सकारात्मक क्लोन लगाने के लिए उठाया जाना चाहिए कि कालोनियों की संख्या चयन के अभाव में काफी बढ़ जाती है कि ध्यान दें। दक्षता में सुधार करने के लिए एक रणनीति के एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है कि एक गैर समेकित करने प्लाज्मिड सह transfect करने के लिए है। कोशिकाओं दो दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति के बाद, लक्षित कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर सकारात्मक प्रतिदीप्ति पर हल और 29 replated जा सकता है। यह प्रक्रिया electroporation द्वारा plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है कि कोशिकाओं के लिए समृद्ध करती है और इस तरह की सेल में एक समवर्ती संपादन घटना की संभावना बढ़ जाती है।
यहाँ वर्णित तकनीक एक साथ कई लोकी 14,46,47 को लक्षित करने के लिए कई गाइड आरएनए का उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। कई प्रोटोकॉल hPSCs अंतर करने के लिए स्थापित किया गया हैविशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में, ब्याज 30 की प्रकार की कोशिकाओं में विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़ की इजाजत दी। कुल मिलाकर, हम भले ही एसएसएन पसंद का hPSCs में कुशल जीनोम संपादन के लिए क्षमता का प्रदर्शन किया है। हम इस तकनीक किसी भी जीनोमिक ठिकाना पर जीन संपादित किया गया है कि isogenic hPSC लाइनें बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि प्रस्ताव।
The authors have nothing to disclose.
इस काम हेलेन Bateup के लिए एक ब्रेन रिसर्च फाउंडेशन बीज अनुदान (BRFSG-2014-02) द्वारा समर्थित किया गया। डिर्क Hockemeyer एलिसन मेडिकल फाउंडेशन की उम्र बढ़ने में एक नया विद्वान है और ग्लेन नींव के साथ ही Shurl और Kay CURCI फाउंडेशन द्वारा समर्थित है। डीएच भी एनआईएच अनुदान 1R01CA196884-01 द्वारा समर्थित है।
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |