Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.
Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) Genomu düzenleme insani gelişmeyi anlamak ve hastalığın patofizyolojisi araştırmak için hangi genetik olarak kontrol ve klinik olarak anlamlı bir platform sağlar. Genom düzenleme için siteye özgü nükleazlardır (Sosyal Güvenlik Numaralarını) kullanılarak, bir başka izogenik ortamda belirli genetik değişikliklerin barındıran yeni hPSC hatlarının hızlı türetme mümkün olur. Çinko parmak nükleazlar (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromic tekrarlar (CRISPR) / Cas9 en sık kullanılan SSNs vardır. Bu nükleazlara her böylece bir genomik lokusta kesin gen düzenleme teşvik, belirli bir sahada iki iplikçikli bir DNA kırılmasının katılmasıyla işlev görürler. SSN-meditasyon genom düzenleme ekleme / silme mutasyonlar veya alt tanıtmak ya hücrenin endojen DNA onarım mekanizmaları, homolog olmayan uç (NHEJ) katılmadan ve homoloji yönettiği onarım iki (HDR), sömürençift sarmallı mola yerinde bir homolog onarım şablonu kullanarak genom er. HPSCs Elektroporasyon gibi floresan gazetecilere ve antibiyotik direnç kasetleri olarak transgenlerin dahil Sosyal Güvenlik Numaralarını ve onarım şablonları transfecting etkin bir yoludur. Elektroporasyondan sonra, antibiyotik direnç seçilerek, tamir yapısı dahil yalnızca hPSCs izole etmek mümkündür. Mekanik hPSC koloniler alınır ve genotipleme boyunca hedef yerde uygun bir entegrasyon teyit doğru hedef ve genetik olarak homojen bir hücre hatlarının izolasyonu sağlar. Bu protokolün geçerliliği EGFP ve puromycin direnç insan pluripotent kök hücreleri AAVS1 güvenli liman mahaline içine inşa dahil her üç SSN platformları kullanarak burada gösterilmektedir.
Genom düzenleme teknolojileri hızla moleküler ve hücre biyolojisi 1 için standart araçları haline gelişmektedir. HPSCs genetik olarak sağlam primer insan hücreleri, bir kendi kendini yenileyen kaynağı temsil insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) genetik mühendisliği, özellikle ilgi çekicidir. hPSCs hastalığı modelleme veya transplantasyon terapisi 2,3 için bir kaynak gibi çeşitli hücre tiplerine ayırt edilebilir. AAVS1 mahalinde bir raportör yapısının hedeflenen entegrasyonu için endojen DNA tamir mekanizmaları ile birlikte siteye özgü nükleazlardır (SSNs) üç farklı tipte kullanan bir protokoldür burada gösterdi. HPSCs içine SSNs transfeksiyonu sonra, muhabir barındıran izojenik hücre popülasyonlarının izole etmek için nasıl gösterilmektedir.
Özellikle pluripotent hücre genomları kök, genom manipüle etme yeteneği kullanarak SSNs çinko parmak nükleazlardır (ZFNs) ve transkripsiyon activat yararı olarak yeni bir fenomen değil,gen düzenleme için veya benzeri bir efektör nükleazlar (Talens) birkaç yıl önce 4-10 gösterilmiştir. Ancak, S. pyogenes CRISPR gelişiyle / Cas9 teknolojisiyle 11-13 ile gen düzenleme 14 yaygın olarak erişilebilir hale gelmiştir. Tüm SSNs homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homoloji yönettiği onarım (HDR) 15 kullanılarak endojen hücresel mekanizmalar tarafından tamir edilir belirtilen hedef sitenin 1,4,5,11 bir çift sarmallı DNA kırılmasını (DSB) tanıtmak. NHEJ hata eğilimli ve yeni elemanlar SSN sahip bir tamir şablonunun ko-transfeksiyon yoluyla uygulanabilir için HDR izin verirken, gen fonksiyonunun kaybıyla sonuçlanan çerçeve kayma mutasyonları neden olabilir. Gen düzenleme kolaylaştırmak DNA tamiri altında yatan ilkeler, her SSN büyük ölçüde aynı olduğu düşünülen edilirken, platformlar arasında bazı farklılıklar dikkat edilebilir. De ZFNs ve novo tasarım esnekliği ve nukleaz optimizasyonu 16 alenen bununla birlikte kullanılmasını sağlarBireysel ZFNs tasarım mevcut montaj kütüphaneleri ve tarama araçları zaman alıcı olabilir. ZFN aracılı hedefleme için istenen lokus belirlendikten sonra, ZFN çiftleri online bir araç ZiFit 17 ile tasarlanabilir. Tasarımı sonra ZFNs modüler plasmid klonlama 18 birkaç tur ile monte edilebilir. Alternatif olarak, birçok ticari olarak temin edilebilen, önceden onaylanmış ZFNs 19 vardır. TALE nükleazlar aynı zamanda online araçları ve kamuya açık bileşenler 17,20 kullanılarak dizayn edilebilir. Örneğin, hızlı bir şekilde TALENS FLASH düzeneğinin 21 veya PCR bazlı bir hiyerarşik Altın Kapı düzeneği 22 kullanılarak yoluyla beş TACE tekrarlarının bloklarından monte edilebilir. SSN tasarımı ve CRISPR / Cas9 kullanarak inşaat hızının kolaylığı yaygın erişilebilir düzenleme aracı genom yaptık. Kılavuz RNA'lar çoklama tek yapı 14 ile birkaç loci hedef için CRISPR kısa kılavuz RNA aracılı hedefleme / Cas9 da izin verir. DizaynHedef mahaline proksimal gen düzenleme için Cas9 bir protospacer bitişik motif (S. için bir NGG trinucleotide Cas9 pyrogenes PAM) sadece kimlik gerektirir. Px330 plasmid 14 içine PAM 20 baz çifti 5 'e karşılık gelen bir oligonükleotid sokulmasıyla, yapı, bir klonlama adımında birleştirilebilir. S. ek olarak pyogenes Cas9, N arasından Cas9 5'-NNNNGATT-3 '(PAM) tanır meningitidis (NmCas9) hPSCs 23 verimli gen düzenleme için izin vermek için gösterilmiştir.
SSK tasarım kolaylığı farklılıklara ek olarak, her bir platform belirli özelliklere sahiptir. Örneğin, ZFNs ve TALENS Cas9 çok oluşturmak uçlu DSBs künt düşünülmektedir ise dört nükleotid 5 'çıkıntı 24 oluşturur Foki nükleaz etki kullanmaktadır. ZFNs, TALENS ve Cas9, açma-kapama hızı hedef DNA, protein stabilitesi açısından farklılık ve DNA tarama modu her biri cteorik düzenleme sonucu 1 küçük farklılıklara neden ould. Ileri çalışmalara tam bu farklılıkların sonuçlarını anlamak için gerekli olacak, biz burada üç platformlarda son derece sağlam ve kolaylıkla genetiği değiştirilmiş hPSCs oluşturmak için kullanılabilecek bir protokol açıklar.
Ne olursa olsun SSN seçim, elektroporasyon hPSCs 25 içine Sosyal Güvenlik Numaralarını ve benzerlik onarım şablonları transfect sağlam bir işlemdir. Antibiyotik direnci için seçimden sonra koloniler hayatta sayısı lokus spesifik parametreler ve düzenleme stratejisi (transgenik ekin ve seçim modu, örneğin boyutu) bağlıdır. Burada açıklanan protokol genellikle yaklaşık 150-400 tek hücreli türetilmiş koloniler halinde sonuçlanır.
Gen-düzenleme, bu protokolü kullanarak AAVS1 loküsündeki önce SSNs 4,5 etkinliğini göstermek için kullanılır olmuştur. AAV-CAGGS EGFP onarım şablonu bir gen tuzak str kullanırategy locus spesifik bir şekilde puromisin direnç kazandırmak için. Kısaca, tamir şablonu yükselticisiz puromisin direnç kasetinin üst kısmında bulunan bir bağlayıcı alıcı alanı ihtiva eder. AAVS1 lokusundaki PPP1R12C geninin ilk intronu içine doğru entegrasyon üzerine, direnç kaseti düzenlenmiş genin promoterinden ifade edilir. Bu özel AAVS1 tahlil sağlamlığı bize her SSN platformunun etkinliğini karşılaştırmak için izin verir.
Sosyal Güvenlik Numaralarını kullanarak Gen düzenleme bozabilir ve / veya teorik herhangi geni değiştirmek için yeteneği verilen güçlüdür. HPSCs bu stratejiyi uygulanması hPSCs daha sonra, nöronlar 26 gibi insan hücre tiplerinin bir çok ayrışmıştır edilebilir, çok yönlü ve çok 27 hepatositlerin ve 28 kardiyomiyositlerin. Buna ek olarak, bir hastada elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin kullanımı, bir hastaya özgü genetik temelinde 29 onarım ya da bilinen hastalığa neden olan mutasyonlar devreye girmesine olanak </sup>, Hastalık mekanizmaları ve hastanın kendi hücrelerini kullanarak test 30 terapötikleri araştırmak için bir platform sağlar. Özetle, hPSCs gen düzenleme insan gelişimi ve hastalığın 31 temel biyoloji araştırmak için etkili ve çok yönlü bir yaklaşımdır.
Gen-düzenlenmiş insan pluripotent kök hücrelerin homojen popülasyonları izole etmek için burada sunulan yöntem hedeflenen loküsündeki sadece farklı izojenik hPSC hatları oluşturmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu hücreler insan hücre farklılaşması ve gelişimi mekanizmaları prob hem de kontrollü bir genetik ortamda monogenik hastalıkların patofizyolojisi anlamak için ideal bir sistem bulunmaktadır. Burada gösterildiği gibi, bu AAVS1 lokusuna yönelik entegrasyonu sağlamak için üç bağımsız SSK tasarım stratejileri (ZFNs, TALENS ve CRISPR / Cas9) kullanmak mümkündür. Bu yöntemlerin her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Potansiyel ZFNs bir avantajı, bir dereceye kadar, TALENS bağımsız nükleaz 42 bağlanma domenlerinin DNA geliştirmek amacıyla yinelemeli mühendisliği sağlar tasarım esnekliği vardır. Bu nukleaz optimizasyonu CRI ile başarılabilir ötesinde ZFNs ve Talens özgünlüğünü artırabilirSPR / Cas9 sistemi. Bu tür seçiciliği, hedef yüksek bir spesifite derecesi gerektiren klinik uygulamalar için önemli olabilir. CRISPR / Cas9 sisteminin en önemli avantajı kullanım kolaylığı olduğunu. TALEN ve ZFN yapım setleri (Addgene 21 aracılığıyla, yani,) kamuya olmasına rağmen sadece gerekli özelleştirme bir 20 baz çifti oligonükleotid olarak px330 plazmidi kullanıldığında, CRISPR / Cas9 tabanlı SSNs (oluşturmak için önemli ölçüde daha kolay Tasarım 14). Bu basitlik kendi çalışmalarında genom düzenleme dahil etmek isteyen araştırma laboratuarları için avantajlı olduğunu kanıtlamaktadır.
Gen-düzenlenmiş hPSC satırları oluşturmak için nucleofection 43, dahil olmak üzere alternatif transfeksiyon teknikleri vardır; Ancak elektroporasyon, tutarlı ve düşük maliyetli 4,5,25 olduğu gösterilmiştir. Nucleofection SSK etkinliği yükselen doğrudan çekirdeğin içine Cas9-kılavuz RNA ribonükleoprotein kompleksleri transfekte etmek için kullanılabilird sadakat 44. MEF'lerden üzerinde hPSCs Büyüyen aşırı farklılaşma olmadan bir pluripotent devlet hPSCs korumak için sağlam ve ucuz bir yöntemdir. Buna ek olarak, bu genetik olarak özdeş kolonilerin kolay izole edilmesini sağlar. Alternatif olarak, bununla birlikte, bu kültür koşulları besleyici göre kültürler daha pahalı olabilir MEF'ler içermeyen kültür hPSCs mümkündür. Bundan başka, tüm süreç çok nadir düzenleme etkinlikleri izolasyonu veya paralel düzenleme deneylerinde, birçok farklı hücre serilerinin jenere edilmesi için izin ölçeklenebilir.
Burada açıklanan protokol sağlamdır; Ancak doğru düzenlenmiş klonlar elde edilebileceği ile verimliliği etkileyen birçok önemli adımlar vardır. Bu yöntem için en kritik bileşeni yüksek kaliteli MEFS ve ilaca dirençli DR4 MEFS yaşıyor. Tek hPSCs sağkalım ince ve düşük kaliteli MEF'ler farklılaşmamış hPSC hatlarının izolasyonu engel olacak. İkinci olarak, Y-27632 kullanımı daanormal karyotip 45 olan hücreler için selektif bir basınç oluşturmadan tek hücre hayatta kalmasını garantileyen, anahtar. Üçüncü olarak, iyi aralıklı koloniler çekme türetilen hücre çizgilerinin genetik homojenlik sağlar. Son olarak, bu açılış birçok küçük parçalar halinde koloni kırmak için yeterince küçük olacak şekilde birden fazla koloniler yeni kuyuda büyüyecek sağlanması, cam pipetler hazırlamak için önemlidir. Bir kopya plaka genotiplemeye izole kolonilerin orijinal plaka bırakarak, kültürde var Bu iyi aralıklı alt-klon toplama izin verir. Bu protokolde zorlu kısmı cam pipetler çekerek manuel; Bu daha önce uygulanmalıdır. Bir cam pipet gerektirmeyen klonu toplama birden çok teknik vardır olduğuna dikkat edilmelidir. Deneyci kendileri için en uygun olanı bulmak için teşvik edilir.
Basit modifikasyonlarla aşılabilir, bu protokole sınırlamalar vardır. O amaçlayan bir deneynly kimin tamir şablonu seçme kaseti içermiyor, düzenlendiği hücrelerin zenginleştiren başka bir yöntem kullanmanız gerekir tamir veya biri olmadan ilgi odağı bozabilir. Pozitif bir klon bulmak için çekilmesi gereken koloni sayısı, seçim yapılmadan büyük ölçüde artırır unutmayın. Verimliliğini artırmak için bir strateji, bir flüoresan proteini eksprese eden bir bütünleşmeyen plazmid birlikte transfekte etmektir. Hücreler iki gün boyunca geri bırakıldıktan sonra, hedef hücreler, flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif kullanılarak pozitif floresans kriteri ve 29 replated olabilir. Bu işlem, elektroporasyon ile plazmit ile transfekte edilmiş hücreler için zenginleştirir ve böylece hücre içinde aynı anda düzenleme olayın olasılığını arttırır.
Burada açıklanan teknikler aynı anda birkaç loci 14,46,47 hedef için birden fazla rehber RNA'ların kullanmak için uzatılabilir. Birçok protokol hPSCs ayırt etmek için kurulmuşturfarklı hücre tiplerine, ilgi 30 hücre tiplerinde çeşitli genetik manipülasyonlar izin. Genel olarak, biz ne olursa olsun SSN seçim hPSCs etkili genom düzenleme potansiyelini ortaya koymuştur. Bu teknik, herhangi bir genomik loküsündeki gen düzenlenmiş olan izojenik hPSC satırları oluşturmak için adapte edilebilir öneriyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Helen Bateup bir Beyin Araştırmaları Vakfı Tohum Grant (BRFSG-2014-02) tarafından desteklenmiştir. Dirk Hockemeyer Ellison Tıp Vakfı Yaşlanma Yeni Bir Scholar ve Glenn Vakfı yanı sıra Shurl ve Kay Curci Vakfı tarafından desteklenmektedir. DH ayrıca NIH hibe 1R01CA196884-01 tarafından desteklenmektedir.
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum (HI) | Life Technologies | 10082-147 | |
Knockout Serum | Life Technologies | 10828-028 | |
Fibroblast Growth Factor – basic | Life Technologies | PHG0261 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
MEM NEAA | Life Technologies | 11140-050 | |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Y-27632 | Calbiochem | 688000 | |
6-well plates | Corning | 3506 | |
12-well plates | Corning | 3512 | |
4mm Electroporation cuvettes | Bio-rad | 165-2081 | |
X-cel gene pulser II | Bio-rad | 165-2661 | |
0.25 % Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
10× Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4 | Life Technologies | 70011-044 | |
Puromycin | Life Technologies | A11138-02 | |
Pasteur pipettes, plugged | VWR | 14672-412 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | S5941 | |
NaCL | Sigma-Aldrich | S9888 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Proteinase-K | Life Technologies | AM2544 | |
Ethanol | VWR | TX89125-172SFU | |
Isopropyl Alcohol | VWR | MK303216 | |
TE Buffer | Life Technologies | 12090-015 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
1.8 ml Cryotubes | ThermoScientific | 377267 |