एक "Humanized" सृजन<em> ड्रोसोफिला</emKinesin -5 के औषधीय निषेध करने के लिए> S2 सेल लाइन संवेदनशील
Summary
This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Abstract
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
Introduction
कोशिका विभाजन के दौरान जीनोम के बराबर अलगाव दोहराया डीएनए और धुरी सूक्ष्मनलिकाएं के बीच सही बातचीत की आवश्यकता है। सूक्ष्मनलिकाएं शारीरिक रूप से kinetochore 1 के रूप में जाना जाता है सेंट्रोमीयरों पर assembles कि प्रोटीन की टुकड़ी के माध्यम से गुणसूत्रों के साथ बातचीत। गुणसूत्रों का सही वितरण बहन गुणसूत्रबिंदुओं जिसमें प्रत्येक बहन विपरीत धुरी डंडे से होने वाले सूक्ष्मनलिकाएं साथ जुड़ा हुआ है, Bioriented रहे हैं कि आवश्यकता है। Kinetochore सूक्ष्मनलिका (के.टी.-मीट्रिक टन) Bioriented रचना में नहीं हैं कि संलग्नक जल्दी से और कुशलता त्रुटि सुधार के रूप में जाना प्रक्रिया में biorientation स्थापित करने का अवसर प्रदान करने के लिए अस्थिर कर रहे हैं। पहले स्तनधारी कोशिकाओं में स्थापित किया गया था कि एक त्रुटि सुधार परख 5 (kinesin -5) Eg5 के खिलाफ प्रतिवर्ती छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग कर Monopolar स्पिंडल कोडांतरण की आवश्यकता है। नशीली दवाओं के उपचार गलत syntelic संलग्नक के एक भीड़ उत्पन्न करता है जो बॉट मेंज बहन गुणसूत्रबिंदुओं एक ही धुरी पोल को देते हैं। दवा की एक बाद वार्शआउट त्रुटि सुधार प्रक्रिया के दृश्य के लिए अनुमति देता है। त्रुटि सुधार परख गलत के.टी.-मीट्रिक टन अनुलग्नकों को सही करने के लिए उम्मीदवार प्रोटीन के योगदान का अध्ययन करने के लिए छोटे अणु inhibitors या knockdowns की उपस्थिति में किया जा सकता है।
जीवित कोशिकाओं में त्रुटि सुधार कल्पना करने की क्षमता आगे इस जटिल प्रक्रिया में शामिल आणविक तंत्र को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, ज्यादातर सेल लाइनों में मौजूद क्रोमोसोम के बड़ी संख्या में अलग-अलग के.टी.-मीट्रिक टन अनुलग्नकों के अवलोकन में एक चुनौती बन गया है। वे के रूप में कुछ के रूप में 4 गुणसूत्रों 6, लेकिन के छोटे अणु अवरोधकों को रोकने के रूप में ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं त्रुटि सुधार परख को लागू करने के लिए आदर्श होगा इस तरह के एस trityl एल सिस्टीन (STLC) के रूप में kinesin 5 और 7-9 monastrol ड्रोसोफिला कोशिकाओं में धुरी विधानसभा या kinesin-5 मोटर समारोह को प्रभावित नहीं करते। इसलिए हम पीढ़ीटेड kinesin -5 अवरोधकों के प्रति संवेदनशील है कि एक inducible प्रमोटर के तहत मानव kinesin -5 व्यक्त एक ड्रोसोफिला S2 सेल लाइन। इस प्रोटोकॉल अंतर्जात ड्रोसोफिला kinesin -5 सजात, Klp61F पछाड़ना, और सेल आधारित त्रुटि सुधार परख में इस सेल लाइन का उपयोग कैसे करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
त्रुटि सुधार Visualizing इस महत्वपूर्ण और जटिल सेलुलर प्रक्रिया में शामिल कदम का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। ऐसा करने के लिए, गलत संलग्नक प्रतिवर्ती अवरोधकों का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं, और त्रुटि सुधार दवा की वार्शआउट पर मनाया जाता है। इस परख मूल रूप स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं 5 का उपयोग कर विकसित किया गया था। हालांकि कई मॉडल स्तनधारी प्रकार की कोशिकाओं में गुणसूत्रबिंदुओं की बड़ी संख्या की उपस्थिति व्यक्ति त्रुटि सुधार की घटनाओं को देख में एक चुनौती बन गया है। ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं त्रुटि सुधार के अवलोकन के लिए उन्हें एक और अधिक बेहतर सेल लाइन बनाने, गुणसूत्रबिंदुओं के रूप में कुछ के रूप में 4 जोड़े के पास है। हालांकि, एक बड़ी खामी कई अवरोधकों ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में अप्रभावी कर रहे हैं। इस प्रकार, मानव kinesin -5 व्यक्त एक humanized ड्रोसोफिला S2 सेल लाइन उत्पन्न करने की क्षमता त्रुटि सुधार का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं हो सकता है एकत्रुटि सुधार का अध्ययन करने के लिए बेहतर सेल लाइन, सेल लाइन प्राप्त करने और आवश्यक जीन नीचे दस्तक में शामिल कई कदम इस तकनीक के लिए कुछ चुनौती बन गया है। उदाहरण के लिए, अभिकर्मक क्षमता काफी कम हो सकता है। कोशिकाओं के कम से कम 20% Eg5-mCherry व्यक्त कर रहे हैं, तो चयन प्रक्रिया में लंबा समय लग जाएगा के रूप में, अभिकर्मक दोहराया जाना चाहिए। इसके अलावा, दोनों फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत समय के साथ कम हो सकती है। यह क्रमश: Eg5-mCherry व्यक्त कोशिकाओं और GFP-α ट्यूबिलिन के लिए चयन करने के लिए Blasticidin एस एचसीएल और hygromycin बी की उपस्थिति में कोशिकाओं बंटवारे से दूर किया जा सकता है। यह ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं कई मानव प्रोटीन और करने के लिए orthologues है कि नोट के लिए भी महत्वपूर्ण है; इसलिए, यह अंतर्जात प्रोटीन के लिए पछाड़ना शर्तों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इष्टतम पछाड़ना की स्थिति dsRNA की राशि और उपचार की लंबाई में भिन्न हो सकते हैं। उद्भव और की तेजी से सुधार को ध्यान में रखते CRISPR-Cas9 तकनीकी15-17 तों, मानव Eg5 द्वारा प्रतिस्थापित Klp61F जीन के साथ एक ड्रोसोफिला सेल लाइन की पीढ़ी अभिकर्मक और पछाड़ना दृष्टिकोण की सीमाओं को पार होता है कि एक शक्तिशाली विकल्प प्रस्तुत करता है। हमारा काम आवश्यक अभिकर्मकों वर्तमान में विकसित किया जा रहा है ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में ऐसा करने के लिए, हालांकि मक्खी को मानव जीन प्रतिस्थापन इस मामले में एक व्यवहार्य विकल्प होना चाहिए कि यह दर्शाता है।
यह प्रक्रिया Eg5 तक सीमित नहीं है, लेकिन ब्याज की अन्य प्रोटीन के समारोह में अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। पहले से ड्रोसोफिला S2 कोशिकाओं में अप्रभावी हो स्थापित किया गया है कि अवरोधकों का उपयोग करते हैं, इस प्रोटोकॉल बंद लक्ष्य प्रभाव के बारे में चिंताओं के बिना जीवित कोशिकाओं में अवरोधकों के प्रत्यक्ष प्रभाव का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन सेल लाइन भी उच्च throughput स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता त्रुटि सुधार में शामिल प्रोटीन को निशाना संभावित दवाओं की पहचान के लिए विश्लेषण करती है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम kinesin -5 निर्माण के उपहार के लिए पेट्रीसिया Wadsworth को धन्यवाद देना चाहूंगा। यह काम, चार्ल्स एच हूड फाउंडेशन, इंक से TJM करने और अनुसंधान अनुदान सं TJM करने ऑफ डाइम्स फाउंडेशन के मार्च से 5 FY13-205, साथ ही समर्थन से एक एनआईएच अनुदान (5 R01 GM107026) द्वारा समर्थित किया गया बोस्टन, एमए। TJM को
Materials
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
| S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
| Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
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