우리는 GFP 형질전환 배경에서 생체 내 세포 추적을 위한 강력하고 간단하며 비용이 저렴한 도구로 광변환 가능한 PSmOrange 시스템을 구축했습니다. 이 프로토콜은 제브라피시 모델 시스템에서의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
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방법 논문
Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적
이 논문에서
요약
초록
세포와 조직의 형광 표지와 함께 투명한 제브라피시 배아(Danio rerio)의 급속한 발달은 살아있는 동물에서 일어나는 발달 과정을 시각화할 수 있게 해줍니다. 관심 세포는 형질전환 라인의 생성을 위한 형광 단백질(FP)의 발현을 유도하기 위해 조직 특이적 프로모터를 사용하여 라벨링할 수 있습니다. 이러한 목적으로 형광 광변환 단백질을 사용하면 발현 도메인 내에서 정의된 구조를 정확하게 따를 수 있습니다. 관심 영역의 단백질을 조명하면 방출 스펙트럼이 변경되고 특정 세포 또는 세포 클러스터가 강조 표시되어 다른 형질전환 세포를 원래 색상으로 남깁니다. 주요 한계는 제브라피쉬의 많은 조직에 대해 알려진 프로모터가 없다는 것입니다. 반대로, 유전자 및 인핸서 트랩 스크리닝은 문자 그대로 모든 배아 구조를 대부분 GFP로 표시하거나 적색 또는 노란색 FP로 확장되는 거대한 형질전환 자원을 생성했습니다. 이러한 형질전환 배경에서 정의된 구조를 따르는 접근 방식은 관심 세포에서 전환될 수 있는 유비쿼터스 광전환성 단백질을 추가로 도입하는 것입니다. 그러나, 이용 가능한 광전환성 단백질은 녹색 및/또는 덜 빈번하게 적색 방출 상태1를 포함하므로 기존 형질전환 계통의 FP-배경에서 세포를 추적하는 데 종종 사용할 수 없습니다. 이 문제를 피하기 위해 제브라피시2,3에 대한 PSmOrange 시스템을 구축했습니다. 이 단백질의 핵 형태를 암호화하는 합성 mRNA의 간단한 미량 주입은 모든 세포핵을 주황색/빨간색 형광으로 표시합니다. 단백질의 표적 광변환에 따라, 방출 스펙트럼을 근적색으로 전환합니다. 단백질의 양자 효율과 안정성으로 인해 PSmOrange는 제브라피시 및 기타 텔레오스트 종을 위한 탁월한 세포 추적 도구가 되었습니다.
서론
기하급수적으로 개선되는 이미징 기술은 최대 약 4일 연속의 기간에 걸쳐 다음과 같은 발달 과정을 가능하게 합니다3. 제브라피시 및 기타 많은 동물 모델 시스템에서 특정 세포, 조직, 축삭 또는 혈관 구조는 시각화를 용이하게 하기 위해 형질전환 녹색 또는 때로는 빨간색 또는 노란색 형광 단백질로 표시됩니다. 그러나, 대부분의 형질전환 세포주에서 전이유전자는 관심 세포에서 특이적으로 발현되지 않을 뿐만 아니라 추가적인 구조도 발현되며, 이는 예를 들어 단일 세포 또는 세포 그룹의 정확한 추적을 방해합니다.
형광 광변환 단백질은 배아 발달 중 세포 추적에 매우 적합합니다. 이러한 단백질의 적용을 위한 전제 조건은 수명이 긴 특성, 변환 시 잘 분리된 방출 범위 및 밝은 형광입니다. 사용 가능한 광전환성 단백질은 Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 또는 Dendra27과 같이 변환 시 방출 범위를 변경하는 단백질과 광활성화될 때만 형광성인 기타 단백질(PAmCherry8, PAGFP9 또는 PATagRFP10)로 구성됩니다. 그러나 기존 FP-형질전환 동물의 세포를 추적하기 ....
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프로토콜
1. H2B-PSmOrange mRNA의 시험 관내 전사 및 mRNA의 정제
- 제조업체의 지시에 따라를 NotI 제한 효소를 사용 PCS2 + 플라스미드를 함유-H2B PSmOrange 선형화.
참고 : mRNA의 오염 및 열화를 방지하기 위해 같은 장갑, 실험실 코트 등의 적절한 보호를 사용하여 다음 단계를 수행합니다. - 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 페놀 - 클로로포름 계 방법을 사용하여 선형화 된 DNA를 정제.
- 제조업체의 지침에 따라 SP6-mRNA의 전사를위한 선형화 템플릿 DNA 1 μg의를 사용합니다.
- 37 ° C에서 10 ~ 20 분 동안 1.0 U의 RNase 무료 DNaseI을 추가하여 DNA를 제거합니다.
- RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 키트를 정리하여 mRNA의 정리.
- mRNA의 순도 및 농도를 증가 6 μL 아세트산 나트륨 (3.0 M, pH를 5.2), 150 ㎕의 96 % 에탄올을 첨가하여 mRNA의 석출. m을 품어최소 30 분에서 24 시간까지 -20 ° C에서 ixed 솔루션입니다.
- 4 ° C에서 45 분 18.407 XG에 솔루션을 회전시켜 mRNA를 수집합니다. 액체를 버리고, 150 ....
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결과
도 1은 PSmOrange 광 변환 시스템의 일례를 도시한다. 뇌의 복잡한은 척추 동물의 등쪽 간뇌의 보존 구조입니다. 많은 다른 척추 동물에서와 마찬가지로,이 단지는 간뇌 왼쪽 양면 parapineal 세포의 중앙에 뇌의 기관으로 구성되어 있습니다. 우아한하지만 시간이 많이 소요되는 uncaging 실험은 parapineal 세포가 뇌의 기관 (13)의 앞쪽 부분에 발생한 것으로 나타났다. TG에서 (foxD3 : GFP); TG (FLH : GFP) 유전자 변형 배아는, 뇌의 및 parapineal 모두 세포를 개발하는 동안 표시되어 있습니다. PSmOrange 시스템의 적합성을 평가하기 위해, 우리는보고 된 솔방울 복잡한 현상 재현이 배아를 사용 하였다. PSmOrange, H2B-PSmOrange의 핵 형태를 인코딩 260 페이지의 mRNA의 모든 세포의 핵에서 단백질을 발현 한 세포 단계 이중 유전자 변형 배아.......
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토론
형광 기자를 운반하는 형질 전환 배아는 배아 발달을 이해하는 것이 근본적으로 도왔다. 그러나, 특정 구조의 특정 시각화를 용이하게하기위한 촉진제 중요한 필요성은 여전히 존재한다. 자신의 부재에서 연구자들은 관심의 그 구조의 기원과 발전에 대해 알고 형광 단백질의 광과 같은 기술에 의존하고 있습니다. 이것은 차례로 개발에 관련된 분자 메커니즘을 식별하는 중요한 조건이다. 제브라 피쉬 분야의 기술 진보는 지금 접근 14,15에 CRISPR-Cas9 매개 노크를 사용하여 예를 들어와 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질의 FP를 교체 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 비교적 시간 소모적 항상 성공적이지. 대조적으로, 보편적으로의 응용 프로그램이 GFP에 H2B-PSmOrange 및 가능한 다른 유전자 변형 배경 표현은 그들을 통해 세포를 수행하는 직선 앞으로 기술이다bryonic 개발.
예를 들어, 제브라 피쉬 복부 habenulae의 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
오리지널 H2B-PSmOrange 플라스미드를 제공해 주신 O. Subach와 물고기 관리를 위한 어류 시설 팀에 감사드립니다. 하이델베르크 대학의 Nikon Imaging Center에서 현미경 장비 및 분석 소프트웨어를 이용할 수 있게 해 준 것에 감사드립니다. CBTM(DFG INST 91027/10-1 FUGG)에서 Core Facility Live Cell Imaging Mannheim의 지원에 감사드립니다. 이 작업은 Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), 하이델베르크 대학과 C.A.B. 및 하이델베르크 대학 만하임 의과대학과 MDG(FOR 1036/2, 298/3-1 및 298/6-1)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PCR 정제 키트 | Qiagen | 28104 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 전사 키트 | Ambion | AM1340 | |
| RNeasy MiniElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | |
| 플라스틱 파스퇴르 | 알파 실험실 | LW4000 | |
| Original H2B-PSmOrange Plasmid | Addgene | 31920 | 논문에 기재된 플라스미드는 다음과 같습니다. Carl lab |
| FemtoJet Microinjector | Eppendorf | 5247 000.013 | |
| Forceps (5 Inox) | NeoLab | 2-1633 | |
| Lab-Tek II 챔버 #1.5 독일 커버글라스 시스템에서 사용 가능 | Nunc | 155382 | |
| Nikon A1R+ | Nikon GmbH 독일 | 번호 | |
| Nikon PLAN Apo λ 20X 공기 목표 | Nikon GmbH 독일 | 번호 | |
| NIS 요소 AR 소프트웨어 (v. 4.30.02) | Nikon GmbH 독일/실험실 이미징 | 번호 |
참고문헌
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
- Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods.
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재인쇄 및 허가
