Bruke Tomoauto: En protokoll for høy gjennomstrømming Automated Cryo-elektron Tomography
Summary
Vi presenterer en protokoll på hvordan man kan utnytte høy gjennomstrømming cryo-electron tomography å bestemme høy oppløsning in situ strukturer av molekylære maskiner. Protokollen tillater store mengder data som skal behandles, unngår vanlige flaskehalser og reduserer ressurs nedetid, slik at brukeren kan fokusere på viktige biologiske spørsmål.
Abstract
Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.
Introduction
Type III sekresjon systemer (T3SS) er viktige virulens determinants for mange Gram-negative patogener. Den injectisome, også kjent som p-komplekset, er den sentrale T3SS maskinen som er nødvendig for direkte translokasjon av effektor-proteiner fra bakterien i eukaryote vertsceller 1, 2. Den injectisome omfatter en ekstracellulær nål, en basal legeme, og en cytoplasmisk kompleks også kjent som sortering kompleks tre. Tidligere studier har belyst 3-D strukturer av rensede injectisomes fra Salmonella og Shigella, sammen med atomstruktur i større basal kroppsproteiner 4, 5. Nylige in situ strukturer av injectisomes fra Salmonella, Shigella, og Yersinia ble åpenbart av kryo-ET 6 , 7. Imidlertid cytoplasmatiske kompleks, avgjørende for valg effektor og nålanordning har ikke blitt visualisert i disse strukturer.
Cryo-ET er most egnet teknikk for å avbilde molekylære maskiner på nanometer oppløsning innenfor sitt opprinnelige cellulære kontekst (in situ). Likevel er den oppnåelige oppløsningen av kryo-ET begrenset av prøvetykkelse. For å overvinne den ulempen, vi avbildes intakte injectisomes i en ondartet Shigella flexneri stamme som ble genmodifisert til å produsere minicells tynne nok for kryo-ET. En annen begrensning av cryo-ET er følsomheten av prøven for stråling indusert av elektronstrålen, som meget raskt ødelegger informasjon med høy oppløsning i prøven. Som et resultat, er ekstremt lave doser som brukes for individuelle tilt-bilder, slik at en passende dosering kan bli fordelt på hele tilt-serien. Dette reduserer i stor grad signal-til-støy-forhold (SNR) i den endelige rekonstruksjon, noe som gjør det vanskelig å skille de strukturelle trekk av emnet fra den store mengden av støy i tomogram og begrenser oppløsningen som kan oppnås ved cryo- ET. Conventional bildebehandling for eksempel Fourier og real-space filtre, så vel som nedover sampling kan brukes til å øke kontrasten, men på bekostning av å filtrere ut mye av den informasjon med høy oppløsning. Nylig har sub-tomogram midling gjort det mulig å øke den SNR og deretter den endelige oppløsning i noen tilfeller til under nanometer nivåer 8, 9. En mer detaljert analyse av kompleksene er gjort mulig ved beregningsmessig å ekstrahere flere tusen under tomograms innehold de områder av interesse fra den opprinnelige tomograms og deretter samkjøre og gjennomsnitt under tomograms å bestemme in situ komplekse strukturer med høyere SNR og høyere oppløsning. Disse metodene kan integreres med genetiske metoder for å gi enda større innsikt i makromolekyl forsamlinger og deres dynamiske conformations i morsmobil sammenheng.
Generelt titalls eller hundrevis av tusen under tomograms må i gjennomsnitt for å bestemme høy-Oppløsning strukturer in situ. Oppkjøpet av et tilstrekkelig antall tilt-serien nødvendig for å produsere dette stort antall under tomograms blir fort en flaskehals. Den resulterende vippeserien er ofte påvirket av stråleinduserte skift, trinnet tilbakeslag, samt forstørrelse, rotasjon og skew defekter, som må løses for å bringe vippe-serien til innretting før rekonstruksjon. Tilt serien er vanligvis justert av sporingsgull fiducial markører, som er tradisjonelt valgt manuelt gjennom inspeksjon av tilt-serien, forårsaker enda en flaskehals. Mange programvarepakker som er utviklet for automatisk tilt-serie oppkjøp gjennom datastyrte elektronmikroskop 10, 11, 12, tilt-serien justering og gjenoppbygging 13, 14 og sub-tomogram gjennomsnitt 15-18. Ettersom disse pakkene håndtere adskilte operasjoner i arbeidsflyten av cryo-ET, blir det ønskelig å bygge opp et høyere abstraksjonsnivå inn i prosessen for å systematisk effektivisere hele ordningen til en enkelt rørledning. Derfor har vi utviklet en programvare wrapper bibliotek "tomoauto" utviklet for å organisere en rekke av disse pakkene i en enkelt semi-automatisert enhet, noe som åpner for enkel bruker drift samtidig opprettholde fulle konfigurasjon av hver komponent i en sentralisert måte. Biblioteket er open-source, godt dokumentert, kontinuerlig utviklet og fritt tilgjengelig for bruk, skreddersydd utvikling eller ytterligere integrering ved hjelp av en elektronisk fjern kildekode repository (http://github.com/DustinMorado/tomoauto).
Dette high-throughput cryo-ET rørledningen har blitt benyttet for å visualisere intakte injectisomes i S. flexneri minicells. Totalt 1,917 tomograms ble generert ved hjelp av denne metoden, avslører en høy oppløsning in situ strukturen intakt maskin inkludert cytoplasma sortering plattformen bestemmes av sub-tomogram gjennomsnitt 19. Sammen med molekylær modellering av villtype og mutant maskiner, gir vår høy gjennomstrømming rørledning en ny vei for å forstå strukturen og funksjonen til intakt injectisome i den innfødte cellular sammenheng.
Protocol
Representative Results
Discussion
The high-throughput metoden beskrevet her gjorde oss i stand til å behandle 1917 cryo tilt-serien og produserer over 4500 under tomograms av intakt S. flexneri injectisome 19. De innsamlede data førte til detaljert karakterisering av in situ injectisome, inkludert cytoplasmatiske sortering kompleks. Fremgangsmåten ble også anvendt for å visualisere flere mutante celler med spesifikk delesjon av antatte proteinkomponenter, som bidro til å klargjøre sammensetningen av sortering…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. William Margolin for kommentarer. Vi er takknemlige for støtten på SerialEM fra legene. David Mastronarde og Chen Xu. DM, BH og JL ble støttet av Grant R01AI087946 fra National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer, Grants R01GM110243 og R01GM107629 fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), og Grant AU-1714 fra Welch Foundation. Den direkte elektrondetektor ble finansiert av National Institutes of Health Award S10OD016279.
Materials
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Tyrptic Soy Broth | Sigma-Aldrich | 22092 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S0692 | |
| Electroporation Apparatus | Bio-rad | 165-2100 | |
| 1 mm Cuvette | BTX | 45-0124 | |
| 1.5 mL Cryogenic Tube | Thermoscientific | 5000-1020 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Sigma-Aldrich | Z336769 | |
| Holey Carbon Grids | Quantifoil (Electron Microscopy Sciences) |
Q2100CR2 | R2/2 200 Cu |
| Glow Discharge Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Vacuum Desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | Used in In-House Glow Discharge Device |
| High-Frequency Generator | Electro-Technic Products | BD-10A | Used in In-House Glow Discharge Device. CAUTION: This device generates high voltages. |
| Centrifuge | |||
| Forceps | Dumont (Electron Microscopy Sciences) |
72705-D | Style 5 Anti-magnetic |
| Colliodal Gold | Aurion | BSA 10nm | |
| Filter Paper | Whatman | #2 | |
| Ethane | Matheson Tri-Gas | UN1035 | |
| Nitrogen | Matheson Tri-Gas | UN1977 | |
| Plunger Device | In-House | Commercial Alternative Available | |
| Cryogenic Grid Storage Box | Electron Microscopy Sciences | 71166-30 | |
| Transmission Electron Microscope | FEI | Tecnai Polara F30 (300 KeV) |
|
| Direct Detection Device Camera | Gatan | K2 Summit | |
| Tomogram Acquisiton Software | SerialEM | http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography | |
| Beam-induced Motion Correction Software | MOTIONCORR | http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires >2GB Nvidia GPU | |
| Tilt-Series Alignment Software | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo | |
| Automatic Fiducial Marker Modelling Software | IMOD | Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 (Usable in tomoauto) |
|
| CTF Determination Software | IMOD | Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (Usable in tomoauto) |
|
| Tilt-Series Reconstruction Software | tomo3d | https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo | |
| Tilt-Series Automated Processing Software | tomoauto | https://github.com/DustinMorado/tomoauto | |
| Particle Picking Software | i3 | http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD | |
| Subvolume Averaging Software | i3 | Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org |
References
- Cornelis, G.R. The type III secretion injectisome. Nat. Rev. Microbiol. 4(11), 811-825 (2006).
- Galan, J.E., Wolf-Watz, H. Protein delivery into eukaryotic cells by type III secretion machines. Nature. 444(7119), 567-573 (2006).
- Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella. typhimurium. type III protein secretion system. Science. 280(5363), 602-605 (1998).
- Schraidt, O., Marlovits, T.C. Three-dimensional model of Salmonella.’s needle complex at subnanometer resolution. Science. 331(6021), 1192-1195 (2011).
- Hodgkinson, J.L., et al. Three-dimensional reconstruction of the Shigella. T3SS transmembrane regions reveals 12-fold symmetry and novel features throughout. Nat. Struct. Mol. Biol. 16(5), 477-485 (2009).
- Kudryashev, M., et al. In situ structural analysis of the Yersinia enterocolitica. injectisome. eLife. 2013(2:e00792) (2013).
- Kawamoto, A., et al. Common and distinct structural features of Salmonella. injectisome and flagellar basal body. Scientific Reports. 3, 3369 (2013).
- Briggs, J.A. Structural biology in situ—the potential of subtomogram averaging. Curr. Opin. Struct. Biol. 23(2), 261-7 (2013).
- Schur, F.K., Hagen, W.J., de Marco, A., Briggs, J.A. Determination of protein structure at 8.5Å resolution using cryo-electron tomography and sub-tomogram averaging. J. Struct. Biol. 184(3), 394-400 (2013).
- Mastronarde, D.N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J. Struct. Biol. 152(1), 36-51 (2005).
- Zheng, S.Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment and reconstruction. J. Struct. Biol. 157(1), 138-47 (2007).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J. Struct. Biol.167(1), 11-8 (2009).
- Kremer, J.R., Mastronarde, D.N., McIntosh, J.R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116(1), 71-6 (1996).
- Winkler, H., Taylor, K.A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt-series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106(3), 240-54 (2006).
- Winkler, H., Zhu, P., Liu, J., Ye, F., Roux, K.H., Taylor, K.A. Tomographic subvolume alignment and classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. J. Struct. Biol. 165(2), 64-77 (2009).
- Nicastro, D., Schwartz, C.L., Pierson, J., Gaudette, R., Porter, M.E., McIntosh, J.R. The Molecular Architecture of Axonemes Revealed by Cryoelectron Tomography. Science. 313(5789), 944-948 (2006).
- Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments. J. Struct. Biol. 178(2), 139-51 (2012).
- Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L.K., Mangold, A.V., Förster, F. PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis. J. Struct. Biol. 178(2), 177-88 (2012).
- Hu, B., et al. Visualization of the type III secretion sorting platform of Shigella flexneri. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.112(4), 1047-52 (2015).
- Iancu, C.V., et al. Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot. Nat. Protoc. 1(6), 2813-9 (2007).
- Chen, S., et al. Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells. J. Vis. Exp. 39, e1943 (2010).
- Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat. Methods. 10(6), 584-90 (2013).
- Xiong, Q., Morphew, M.K., Schwartz, C.L., Hoenger, A.H., Mastronarde, D.M. CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series. J. Struct. Biol. 168(3), 378-87 (2009).
- Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L.R., Elidan, G., Downing, K.H, Horowitz, M. Markov random field based automatic image alignment for electron tomography. J. Struct. Biol.161(3), 260-75 (2008).
- Rouhou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. bioRxiv. (2015).
- Agulleiro, J.I., Fernandez, J.J. Tomo3D 2.0 – Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction. J. Struct. Biol. 189(2), 147-52 (2015).
- Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M.A., Miller, K., James, M., Charon, N.W., Manson, M.D., Norris, S.J., Li, C., Liu, J: Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi. Proc Natl Acad Sci. U S A., 110(35), 14390-5 (2013).
- Hu, B., Margolin, W., Molineux, I.J., Liu, J: The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection, Science. 339(6119), 576-9 (2013).
- Liu, J., Hu, B., Morado, D.R., Jani, S., Manson, M.D., Margolin, W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli. minicells. Proc Natl Acad Sci. USA. 109(23), E1481-8 (2012).
- Russo, C.J., Passmore, L.A: Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346(6215), 1377-80 (2014).
