एक साथ मात्रा के लिए एक डुप्लेक्स डिजिटल पीसीआर परख<em> उदर एसपीपी।</em> और वाटर्स में मानव मल से जुड़े HF183 मार्कर
Summary
यह पांडुलिपि एक डुप्लेक्स डिजिटल पीसीआर परख है कि एक साथ उदर एसपीपी यों इस्तेमाल किया जा सकता है। और मनोरंजन पानी में सामान्य और मानव-मल जुड़े संदूषण के संकेतक के रूप HF183 आनुवंशिक मार्करों का वर्णन है।
Abstract
यह पांडुलिपि Enterococcus एसपीपी के एक साथ मात्रा का ठहराव। और मानव मल से जुड़े HF183 मार्कर के लिए एक डुप्लेक्स डिजिटल पीसीआर परख (EntHF183 dPCR) का वर्णन है। EntHF183 द्वैध dPCR (EntHF183 dPCR के रूप में भेजा hereon) परख अपनी प्रकाशित व्यक्ति मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) समकक्षों के रूप में एक ही किताब और जांच के दृश्य का उपयोग करता है। इसी तरह, एक ही पानी छानने का काम और डीएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं के रूप में qPCR करने से पहले किया dPCR चल रहा से पहले पालन कर रहे हैं। हालांकि, डुप्लेक्स dPCR परख qPCR assays पर कई फायदे हैं। सबसे महत्वपूर्ण है, dPCR परख एक मानक वक्र चल रहा है और इसलिए लिए की जरूरत है, जुड़े पूर्वाग्रह और परिवर्तनशीलता, अपने लक्ष्य के प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव द्वारा समाप्त। इसके अलावा, जबकि (यानी एक साथ मात्रा का ठहराव) उदर और qPCR में HF183 duplexing अक्सर एक नमूने में कम प्रचुर मात्रा में लक्ष्य के गंभीर मूल्यवान समझना की ओर जाता है, dPCR दोनों लक्ष्यों के अनुरूप मात्रा का ठहराव प्रदान करता है, whetउसकी व्यक्तिगत रूप से या एक साथ एक ही प्रतिक्रिया में मात्रा निर्धारित किया। dPCR परख भी पीसीआर अवरोध सांद्रता कि परिमाण qPCR द्वारा सहन उन लोगों की तुलना में अधिक के आदेशों 01:59 हैं बर्दाश्त करने में सक्षम है। ये लाभ EntHF183 dPCR परख विशेष रूप से आकर्षक है क्योंकि यह एक साथ दो अलग qPCR assays चलाने के लिए आवश्यकता के बिना पर्यावरण पानी में दोनों सामान्य और मानव-मल जुड़े संदूषण पर सटीक और repeatable जानकारी प्रदान करता है। qPCR पर अपने फायदे के बावजूद, वर्तमान में उपलब्ध उपकरण के साथ dPCR परख की ऊपरी सीमा की मात्रा का ठहराव लगभग परिमाण qPCR द्वारा प्राप्त की तुलना में कम है कि चार में से आदेश है। नतीजतन, इस तरह आम तौर पर कमजोर पड़ने सीवेज फैल निम्नलिखित मनाया उन लोगों के रूप में लक्ष्य जीवों की उच्च सांद्रता की माप के लिए की जरूरत है।
Introduction
मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) तरीकों में व्यापक रूप से, क्योंकि वे तेजी से और अधिक लचीला और पारंपरिक संस्कृति आधारित विधियों की तुलना में विशिष्ट हैं मनोरंजक पानी की गुणवत्ता की निगरानी और माइक्रोबियल स्रोत आवेदन पर नज़र रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है। नतीजतन, qPCR संशोधित USEPA मनोरंजन पानी की गुणवत्ता मानदंड 1 में इस तरह के उदर एसपीपी के रूप में सामान्य मल संकेतकों के लिए तेजी से पानी की निगरानी परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है।। कई qPCR assays भी विकसित और पर्यावरण के जल 2 में मल प्रदूषण के स्रोतों की पहचान के लिए मान्य किया गया है। इन के अलावा, HF183 मार्कर assays के सबसे अधिक बार मानव-मल जुड़े संदूषण 3 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल शामिल हैं।
हालांकि, qPCR परिणाम अक्सर पक्षपातपूर्ण हो सकता है क्योंकि वे मात्रा का ठहराव के लिए मानक घटता पर भरोसा करते हैं। qPCR एक स्टेन से उनकी मात्रा का ठहराव चक्र (सीक्यू) interpolating द्वारा नमूनों में लक्ष्य के अज्ञात सांद्रता quantifiesदर्द की अवस्था है कि Cq और क्रमानुसार-पतला मानकों का एक सेट के लघुगणक मात्रा के बीच एक रैखिक संबंध का वर्णन है। विश्वसनीय और संगत मानक संदर्भ सामग्री का अभाव इसलिए बहुत qPCR परिणाम पूर्वाग्रह कर सकते हैं। अध्ययन से पता चला है कि qPCR परिणाम विभिन्न विक्रेताओं से 4 मानकों का प्रयोग लगभग आधे से एक लॉग से भिन्न है और एक ही विक्रेता से 5 मानकों के विभिन्न बैचों का उपयोग कर 2 गुना से।
डिजिटल पीसीआर (dPCR) तकनीक लघु PCRs की बड़ी संख्या है कि हजारों या वर्दी nanoliter या picoliter प्रतिक्रियाओं 6 के लाखों में एक थोक qPCR विभाजन से उत्पन्न कर रहे हैं में सकारात्मक की आवृत्ति की गणना के द्वारा एक अज्ञात नमूना quantifies। यह छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (यानी, इस लेख) या चैम्बर डिजिटल पीसीआर, क्रमशः के रूप में जाना जाता है, तो विभाजन पानी में तेल की बूंदों (यानी, इस लेख) या एक चिप पर छोटे कक्षों हैं। एक उच्च नमूना एकाग्रता लक्ष्य डीएनए की उपस्थिति में परिणाम होगा(इसलिए सकारात्मक पीसीआर) विभाजन की एक उच्च अनुपात में, एक रिश्ता पॉसों वितरण द्वारा approximated। जैसे, द्विआधारी परिणाम (सकारात्मक या नकारात्मक पीसीआर) दर्ज कर रहे हैं और सकारात्मक बूंदों की आवृत्ति पॉसों सन्निकटन के माध्यम से सीधे अज्ञात नमूना सांद्रता गणना करने के लिए, qPCR में के रूप में एक मानक वक्र के लिए आवश्यकता को नष्ट किया जाता है।
डिजिटल पीसीआर गुणात्मक रूप से इस द्विआधारी प्रकृति qPCR 7 पर अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है। क्योंकि देरी प्रवर्धन अभी भी एक सकारात्मक पीसीआर उपज कर सकते हैं, dPCR मात्रा का ठहराव निषेध कि प्रवर्धन क्षमता कम कर देता खिलाफ और अधिक मजबूत है। इसी तरह, dPCR मात्रा का ठहराव Cq मूल्यों में परिवर्तनशीलता से प्रभावित नहीं है के रूप में, qPCR है qPCR 8-10 की तुलना में dPCR के उच्च परिशुद्धता के लिए अग्रणी।
इसके अलावा, विभाजन की प्रक्रिया, एक छोटी बूंद में लक्ष्य डीएनए की एक बहुत छोटी राशि सुनिश्चित करता है को प्रभावी ढंग से सब्सट्रेट प्रतियोगिता को न्यूनतम (amplificatio दौरानअलग डीएनए लक्ष्य) कि (यानी एक परख एक साथ दो लक्ष्यों को डीएनए के उपाय) qPCR में duplexing को प्राप्त करने के लिए आम बाधाएं हैं के एन। जैसे, चाहे द्वैध या सिंप्लेक्स में रन (यानी एक लक्ष्य के लिए एक एकल परख में मापा जाता है) dPCR दोनों लक्ष्यों को 7,11 के लगभग अप्रभेद्य मात्रा का ठहराव पैदा करता है।
डिजिटल पीसीआर परख (EntHF183 dPCR) इस आलेख में वर्णित के लक्ष्य के सामान्य मल सूचक Enterococcus एसपीपी के एक साथ प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए है। और मानव-मल जुड़े सुधार परिशुद्धता, reproducibility और निषेध के खिलाफ मजबूती के साथ HF183 मार्कर अपने qPCR की तुलना समकक्षों। इस परख सफलतापूर्वक पर्यावरण मीठे पानी, समुद्री पानी, और विभिन्न fecal सामग्री 7 में मल प्रदूषण को बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह भी पानी और अपशिष्ट जल के किसी भी अन्य प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। इस परख की वजह से इसे करने के लिए तलछट या मिट्टी का विश्लेषण करने के लिए महान वादा धारणनिषेध करने के लिए उच्च सहिष्णुता है, लेकिन अवरोध के नमूनों की इन प्रकारों में घोला जा सकता है आगे के परीक्षण क्योंकि जटिलताओं के लिए जरूरी है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे पहले, परख मिश्रण के मिश्रण के लिए मुश्किल हो सकता है क्योंकि मास्टर मिश्रण पारंपरिक qPCR मास्टर घोला जा सकता है और अधिक से अधिक चिपचिपा है। सरल vortexing अपर्याप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Low Bind Microtubes | Costar | 3207 | For storage of reagents, samples/production of master mixes |
| Nuclease Free Water | FisherSci | BP2484-50 | |
| TE pH 8 buffer | FisherSci | BP2473-100 | |
| Hardshell 96 Well Plate | BioRad | HSP-9601 | For initial master mix and sample inoculation |
| Aluminum Sealing Film | BioRad | 359-0133 | To seal sample plate |
| Droplet Generator | BioRad | 186-3002 | |
| Droplet Generation Oil | BioRad | 186-3005 | |
| Cartridge | BioRad | 186-4008 | |
| DG8 Cartridge Holder | BioRad | 186-3051 | |
| Gasket | BioRad | 186-3009 | |
| 20uL pipet tips | Rainin | GP-L10F | For tansferring sample/master mix to cartidge |
| 200uL pipet tips | Rainin | GP-L200F | For transferring droplets to final Twin.Tec Plate |
| Twin.Tec 96 Well Plate | Eppendorf | 951020320 | For final droplets thermal cycling and reading |
| Pierceable Heat Seal Foil | BioRad | 181-4040 | To seal Twin.Tec plate before thermalcycling |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 181-4000 | Only the thermal cycler is needed, no optics |
| CFX96 Thermalcycler | BioRad | CFX96 and C1000 | |
| QX100 Droplet Reader | BioRad | 186-3001 | |
| Droplet Reader Oil | BioRad | 186-3004 | |
| Droplet PCR Supermix | BioRad | 186-3024 | i.e. the digital PCR mix in manuscript |
| QuantaSoft software (v1.3.2) | Quantasoft | QX100 | For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data |
| Entero Forward Primer (Ent F1A) | Operon | GAGAAATTCCAAACGAACTTG | Alternative vendor can be used |
| Entero Reverse Primer (Ent R1) | Operon | CAGTGCTCTACCTCCATCATT | Alternative vendor can be used |
| Entero Probe (GPL813TQ) | Operon | [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] | Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM |
| HF183 Forward Primer (HF183-1) | Operon | ATCATGAGTTCACATGTCCG | Alternative vendor can be used |
| HF183 Reverse Primer (BthetR1) | Operon | CGTAGGAGTTTGGACCGTGT | Alternative vendor can be used |
| HF183 Probe (BthetP1) | Operon | [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1] |
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. |
| Positive control | Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA. |
References
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