Isolatie en karakterisering van de Muis Antral Eicellen Gebaseerd op Hergroepering van nucleoli chromatine Organization
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de karakterisering van muis antral eicellen gebaseerd op nucleolair organisatie.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Antrale volgroeide eicellen (GV, kiemblaasje) geïsoleerd uit de antrale compartiment van het ovarium worden routinematig gebruikt voor verschillende doeleinden zoals bijvoorbeeld het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen achter in vitro rijping tot metafase II stadium.
Ondanks hun mooie uiterlijk meest antral eicellen, maar niet alle, zijn in staat om de meiose te voltooien en bereiken de blastocyststadium; in feite, vele zoogdiersoorten, waaronder mensen 1,2, ongeveer 30% van hen arrestatie hun ontwikkeling op de 2-cel stadium, wanneer bevruchting plaatsvindt 3-5. Tot op heden zijn enkele parameters die worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de eicellen in staat om de embryonale ontwikkeling van die daartoe niet in staat te houden.
Bijvoorbeeld, cresyl blauw kleuring (BCB) is een valide methode om de oöcyten basis van de activiteit van glucose-6-fosfaat-dehydrogenase sorteren, hoewel het nut van deze sorteermethode verband met BCB + of BCB- kleuringnog laboratorium afhankelijk 6-8.
Een andere bekende methode woont in hun chromatine organisatie: als gekleurd met elke DNA intercalerende kleurstoffen (zoals Hoechst33342), 70% van de antrale eicellen laten een dye-positieve ring rond de nucleolus en heten Omringd Nucleolus (SN), terwijl de resterende 30% tonen een gevlekte positieve signalen en heten niet omringd Nucleolus (NSN) 3-5. Recent toonden we aan dat het ontbreken van cytoplasma roosters 9 (CPLS belangrijke opslagplaatsen voor maternale mRNA en ribosomen in zowel zoogdieren eicellen en embryo's) 10 en de down-regulatie van MATER (essentieel voor CPLS vorming 11), samen met de aanwezigheid van vetdruppels in hun cytoplasma 9,12, kunnen andere oorzaken verband met de NSN eicellen onvermogen verder komt dan het 2-cel stadium.
Helaas kan paar technieken worden toegepast op antrale SN en NSN eicellen en sorteren,Daarom zou de ontwikkeling van een minder invasieve werkwijze (zonder nucleaire kleuring, fixatie of manipulatie met de mond pipetten) zeer belangrijk geworden om de tarieven van menselijke en dierlijke embryo ontwikkeling.
In dit artikel hebben we detail de eenvoudige en snelle protocol dat wordt gebruikt om ad soort SN en NSN antrale eicellen van vrouwelijke muizen te isoleren en het is gericht tot alle wetenschappers geïnteresseerd in de studie van de vrouwelijke gametogenese, eicel maturatie en embryo-ontwikkeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de methode die wordt gebruikt om te isoleren en te classificeren muis antral GV eicellen. Er zijn geen specifieke kritische stappen te onderstrepen, met enkele uitzonderingen. Ten eerste: deze procedure moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om: a) behoud van de vitaliteit van de eicellen en b) voorkomen pH veranderingen in het gebruikte medium. Ten tweede: eicellen moeten kort worden opgewekt (5-10 sec) om Hoechst33342 chromatine schade en daaropvolgende dood van de oöcyten te voorkomen, voora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
