Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu
Summary
Burada Nükleolar organizasyon dayalı fare antral oosit karakterizasyonu için bir protokol mevcut.
Abstract
This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.
Introduction
Yumurtalık antral bölümünden izole antral tam olarak büyümüş oositler (GV, germinal vesicle) rutin gibi farklı amaçlar için kullanılabilir, örneğin, Metafaz II aşamaya kadar in vitro olgunlaşması arkasına moleküler ve hücresel mekanizmalar çalışma.
Onların güzel bir görünüm en antral oosit rağmen ama hepsi değil, mayoz tamamlamak ve blastosist aşamasına ulaşabiliyorlar; döllenme 3-5 oluşursa aslında, insanlar 1,2 dahil olmak üzere birçok memeli türlerinde, içinde, bunların yaklaşık% 30, 2-hücreli aşamada kendi gelişimini tutuklama. Bugüne kadar, birkaç parametre bunu yapamaz olanlardan embriyo gelişimini sürdürmek mümkün oosit ayırt etmek için kullanılır.
Örneğin, kresil mavi boyama (BCB) BCB + veya BCB- boyama ile ilgili olan bu sıralama yöntemi programı olmasına rağmen glikoz-6-fosfat dehidrojenaz aktivitesi göre oosit sıralamak için geçerli bir yöntemdirHala 6-8 bağımlı laboratuvar.
Başka köklü yöntem kendi kromatin organizasyonu bulunur: (Hoechst33342 gibi) herhangi bir DNA interkalasyon boyalarla boyanmış ise, antral oosit% 70 çekirdekçik etrafında bir boya pozitif halka göstermek ve Nukleolus (SN) çevrili denir olan% 30 kalarak Bir daha benekli olumlu sinyaller ve (NSN) 3-5 değil çevrili Nukleolus denir. Son zamanlarda biz gösterdi sitoplazmik örgülerde 9 (CPLS, memeli oosit ve embriyoların hem maternal mRNA ve ribozomlar için önemli depolama siteleri) olmaması 10. ve varlığı ile birlikte (CPLS oluşumu 11 için gerekli) MATER aşağı-regülasyonu, Onların sitoplazmalarında 9,12 lipid damlacıkları, 2-hücre aşamasına ötesine devam etmek NSN oosit yetersizlik ile ilgili diğer nedenler olabilir.
Ne yazık ki, bazı teknikler antral SN ve SDİ oosit ve sıralamak için uygulanabilir,Bu nedenle, (nükleer boyanma, tespit prosedürleri ya da ağız pipetler ile manipülasyon olmadan) daha az invazif yöntem geliştirilmesi hem insan ve hayvan embriyo gelişimi oranlarını artırmak için çok önemli hale gelebilir.
Bu yazıda, detay, basit ve hızlı bir protokol reklam sıralama SN ve dişi farelerden alınan NSN antral oosit izole etmek için kullanılan ve kadın gametogenez, oosit olgunlaşması ve embriyo gelişimi çalışmasında ilgilenen tüm bilim adamlarına hitap etmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol yalıtmak ve fare antral GV oosit sınıflandırmak için kullanılan yöntem açıklanır. Birkaç istisna dışında, altını çizmek için özel bir kritik adımlar vardır. A) oosit canlılığını korumak ve b) kullanılan ortamda pH değişiklikleri önlemek: Birincisi: Bu prosedür mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. İkincisi: oosit IVM ve IVF Aşağıdaki adımlar, özellikle kromatin hasar ve oosit sonraki ölümünü önlemek için Hoechst33342 (5-10 sn) kısaca heyecanlı olmalıdır. B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.M. and C.A.R. acknowledge the financial support of the Ministero della Salute, Ricerca Finalizzata/giovani ricercatori anno 2009 of the Fondazione IRCCS Ospedale San Matteo, Pavia (I). M.M and C.A.R. wish to thank Marianna Longo for helping with the images preparation.
Materials
| PMSG | Sigma | G4527 | |
| EmbrioMax M2 | Millipore | MR-015-PD | |
| Hoechst33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| Cell Culture Dish 35mmx10mm | Corning | 430165 | |
| µ-Dish 35mm, high glass bottom | Ibidi | 81158 | |
| Pipette Pasteur Borosilicate | Corning | 7095D-9 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes | Sigma | A5177 |
References
- Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data). Gamete Res. 22 (2), 219-231 (1989).
- Anderiesz, C., Ferraretti, A. P., Magli, C., Fiorentino, A., Fortini, D., Gianaroli, L., Jones, G. M., Trounson, A. O. Effect of recombinant human gonadotropins on human, bovine and murine oocyte meiosis, fertilization and embryonic development in vitro. Human Reprod. 15 (5), 1140-1148 (2000).
- Mattson, B. A., Albertini, D. Oogenesis: Chromatin and microtubule dynamics during meiotic prophase. Mol. Reprod. Dev. 25 (4), 374-383 (1990).
- Debey, P., Szollosi, M. S., Szollosi, D., Vautier, D., Girousse, A., Besomber, D. Competent mouse oocytes isolated from antral follicles exhibit different chromatin organization and follow different maturation dynamics. Mol. Reprod. Dev. 36 (1), 59-74 (1993).
- Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. Chromatin organisation during mouse oocyte growth. Mol. Reprod. Dev. 41 (1-2), 479-485 (1995).
- Wu, Y. G., et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining: a study using the mouse model. Cell Res. 17, 722-731 (2007).
- Opiela, Y., Kątska-Książkiewicz, L. The utility of Brilliant Cresyl Blue (BCB) staining of mammalian oocytes used for in vitro embryo production (IVP). Reproductive Biol. 13, 177-183 (2013).
- Labrecque, R., Sirard, M. A. The study of mammalian oocyte competence by transcriptome analysis: progress and challenges. Mol. Human Reprod. 20 (2), 103-116 (2014).
- Monti, M., Zanoni, M., Calligaro, A., Ko, M. S., Mauri, P. L., Redi, C. A. Developmental arrest and mouse antral Not-Surrouded Nucleolus oocyte. Biol. Reprod. 88 (1), 1-7 (2013).
- Yurttas, P., et al. Role for PADI6 and the cytoplasmic lattices in ribosomal storage in oocytes and translational control in the early mouse embryo. Development. 135 (15), 2627-2636 (2008).
- Li, L., Baibakov, B., Dean, J. A subcortical maternal complex essential for preimplantation mouse embryogenesis. Dev. Cell. 15 (3), 416-425 (2008).
- Ami, D., et al. FT-IR spectra signatures of mouse antral oocytes: molecular markers of oocyte maturation and developmental competence. Biochim. Biophys. Acta. 1813 (6), 1220-1222 (2011).
- Fulton, B. P., Whittingam, D. G. Activation of mammalian oocytes by intercellular injection of calcium. Nature. 273 (5658), 149-151 (1978).
- Luttmer, S. J., Longo, F. J. Examination of living and fixed gametes and early embryos stained with supravital fluorochromes (Hoechst 33342 and 3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide). Gamete Res. 15 (3), 267-283 (1986).
- Monti, M., Redi, C. A. The biopolitics of frozen embryos. Int. J. Dev. Biol. 55, 243-247 (2011).
