We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
rabattues de l'ARN à médiation sont largement utilisés pour contrôler l'expression des gènes. Cette famille de techniques polyvalent utilise de l'ARN court (ARNs) qui peut être synthétisée avec une séquence quelconque, et destiné à compléter n'importe quel gène ciblé pour le silençage. Étant donné que ARNs constructions peuvent être introduites à de nombreux types de cellules, directement ou en utilisant une variété de vecteurs, l'expression génique peut être réprimée dans les cellules vivantes sans modification génétique laborieuse. L'ARN le plus commun de la technologie knockdown, l'interférence ARN (ARNi), fait usage de la reconnaissance de la séquence endogène ARN-induite silençage complexe (RISC) de médiation et de clivage de l'ARNm cible. Les applications de cette technique sont donc limités à des organismes de type RISC, principalement exprimant eucaryotes. Récemment, une nouvelle génération de biotechnologistes d'ARN ont développé des mécanismes alternatifs pour contrôler l'expression des gènes par ARN, et ainsi rendu possible rabattues de gènes ARN médiée par des bactéries. Nous décrivons ici une méthode pour faire taire expres de gènession dans E. coli qui ressemble fonctionnellement ARNi. Dans ce système, un phagemide synthétique a été conçu pour exprimer des ARNs, qui peut conçu pour cibler une séquence quelconque. La construction d'expression est délivrée à une population de E. coli avec des cellules non lytique du phage M13, après quoi il est capable de se répliquer de manière stable comme un plasmide. La reconnaissance antisens et le silençage de l'ARNm cible est médié par la protéine Hfq endogènes à E. coli. Ce protocole comprend des procédés pour la conception de l'ARNs antisens, la construction du vecteur phagémide, le conditionnement du phagemide dans bactériophage M13, la préparation d'une population de cellules vivantes pour l'infection, et en effectuant l'infection elle-même. La protéine fluorescente mKate2 et chloramphénicol acétyltransférase du gène de résistance aux antibiotiques (CAT) sont ciblés pour générer des données représentatives et de quantifier l'efficacité knockdown.
rabattues de gènes ARN médiée procèdent en deux étapes. Tout d'abord, une molécule d'ARN est introduit dans une lignée cellulaire ou d'un organisme d'étude. Deuxièmement, les protéines liant l'ARN endogènes, faciliter la reconnaissance de l'ARN-cible et de produire l'effet de silençage. Toutes les technologies d'ARN knockdown bénéficient de la nature personnalisable des ARNs synthétiques, qui peut être facilement produit pour correspondre à une cible d'intérêt spécifique. Cependant, les détails moléculaires de l'absorption de l'ARN et le silençage varient considérablement d'un système modèle, contraignant où et comment passes rabattues d'ARN peuvent être appliquées.
Dans les nématodes, l' ARN double brin (ARNdb) molécules peut être introduit directement dans les médias ou en alimentant les vers avec une population de ARNdb exprimant E. 1,2 cellules de E. coli. Chez la drosophile, l' ARNi peut être obtenue par micro – injection d' embryons à partir d' ARNdb 3, ou mis en œuvre dans des lignées cellulaires en ajoutant simplement l' ARNdb dans le milieu de culture 4. Dans les lignées cellulaires de mammifères,synthétiques petits ARN interférents (siRNA) peuvent être délivrés à des cellules vivantes par électroporation 1,2,5, emballés dans des liposomes 3,6, ou exprimés à partir de vecteurs d' ADN plasmidique 4,7. Une fois que les espèces d'ARN atteint le cytosol, la voie de l'ARNi repose sur le complexe RISC pour traiter ARNdb, faciliter la reconnaissance antisens de la cible, et de catalyser la répression traductionnelle, la dégradation de l'ARNm, ou de la formation hétérochromatine, en fonction de l'hôte.
En raison de ces exigences, l'ARNi classique peut être effectuée que dans les organismes qui prennent l'ARN exogène efficace et expriment RISC ou une activité RISC-like. Notamment, cela exclut le modèle bactérie E. coli, qui n'a pas la voie ARNi. Cependant, les progrès récents en biologie synthétique fournissent les outils nécessaires pour résoudre à la fois le problème de livraison et le problème de silence.
Dans ce protocole, les constructions ARNs sont exprimés en E. coli à partir d' un vecteur d'ADN délivré à liVing cellules en utilisant le système phagémide / helper M13. Un phagemide est tout plasmide ayant une origine f1 phage dérivé de replication. Un plasmide auxiliaire, dans ce cas M13KO, porte toute la machinerie nécessaire pour produire des particules virales, mais pas assez compétent pour la réplication et l'emballage. Quand un phagémide et plasmide auxiliaire sont co-transformées, le phagemide seul est répliqué à l'origine f1, emballé et sécrétée. Le phagemide vectorisé est alors capable d'infecter en direct E. coli via le pilus F.
Dans ce système, l'effet de silençage est produite par des cassettes d'ARNs personnalisées combinant une séquence d'échafaudage avec une séquence de liaison à la cible. La séquence de liaison à la cible est de 24 paires de bases antisens à un ARNm cible, typiquement au niveau du site de liaison au ribosome (RBS). La séquence d'échafaudage, développé par Na et ses collègues 8, contient un motif Hfq contraignant extrait de MICC, un petit ARN régulateur endogène E. coli. La protéine Hfq stimule l'ARN-ARN binding et la dégradation de l' ARNm, servant un rôle dans ce système similaire à RISC dans l' ARNi. La figure 1 illustre un schéma complet pour rabattues de ARNs phages à médiation, y compris la structure ARNs de cassette, vectorisation phagemide, et le mécanisme taire.
En tant que méthode pour moduler l' expression génique dans E. coli, ARNs silencing est simple, rapide et polyvalent. E. ciblée coli est pas surchargé au – delà de la propagation du phagemide et exprimant le ARNs. Cela peut être pertinent dans le contexte de la biologie synthétique ou la recherche fondamentale où l'expression des plus grandes constructions hétérologues peut grever les ressources cellulaires 9. Phagemides avec de nouvelles cibles peuvent être produites par une seule PCR et a récolté un jour après la transformation phagémide. Enfin, presque tous les ARNm peut être ciblé. La cassette de régulation ARNs (sur un plasmide standard) a été montré pour travailler sur une variété de cibles dans le métabolisme avec des niveaux de répression typiques> 90% 8.
<p class = "jove_content"> Ce protocole se reproduit et se développe sur des travaux antérieurs utilisant phagemide-né ARNs cassettes 10. Tout d' abord, un phagemide emballé est introduit dans une culture de E. batch coli et les cellules utilisées pour réduire au silence l' expression de la protéine fluorescente mKate2. changements de fluorescence suivants sont surveillés en temps réel. Deuxièmement, abattre le gène CAT est indiqué pour réduire la résistance au chloramphénicol phénotypique sur des plaques d'agar-agar. Dans les deux cas, le phagémide lui-même porte un marqueur GFP, permettant ainsi le taux d'infection à mesurer indépendamment l'un de l'efficacité knock-down.Le présent procédé atteint 80% de réduction des niveaux de fluorescence mKate par rapport aux témoins non ciblés. Ceci est en ligne avec d' autres méthodes knockdown d'ARN, où silençage complète est pas observée et 50-90% d' efficacité est typique 16,17. Au niveau phénotypique, rabattues CAT ciblées ont pu atténuer de manière significative la résistance au chloramphénicol, et l'éliminer sous certaines conditions.
Le phénotype knockdown était détectable au niveau de la population après seulement un post-infection quelques heures (figure 3B). Ceci illustre une caractéristique importante de la livraison basée sur les phages: une fréquence knockdown élevée peut être obtenue directement en culture discontinue sans modification génétique préalable. A la différence des modifications génétiques classiques, en utilisant une transformation de plasmide ou d'intégration génomique, l'infection par le phage ne nécessite pas qu'une population re-cultivé à partir d'une seule colonie isolée. Ceci permet aux effets de l'infection par des phages pour être explored dans les populations dynamiques spatiales complexes 11, avec des structures spatiales préexistantes comme biofilms 18, ou dans les populations naturelles génétiquement mixtes 19.
Une étape cruciale dans cette méthode est la production de phagemide emballé à titre élevé. La charge métabolique associé à la production de particules de phage peut conduire à des taux élevés de mutation ou perte de plasmide dans la souche de production phagemide. Il est recommandé que la souche de production phagémide être cultivées directement à partir d'une seule colonie cotransformé et non réfrigérée, congelée ou sous-cultivées avant la récolte de phage. Une faible efficacité de la co-transformation peut également être observé lors de l' introduction du phagemide et le plasmide auxiliaire à E. coli simultanément. Dans ce cas, des rendements plus élevés peuvent être obtenus en transformant le plasmide auxiliaire d'abord, puis la préparation de cellules compétentes portant le plasmide auxiliaire pour la transformation ultérieure avec le phagémide.
Phainfection gemid ou l'expression d'ARNs impose aussi une charge métabolique détectable sur les cellules cibles, et peuvent entraîner une certaine perturbation phénotypique. Par exemple, une réduction de la fluorescence mKate2 n'a été observé même lorsque les cellules ont été infectées avec un phagemide de ciblage CAT (figure 3). L' infection par le M13 est pas pensé pour déclencher des réactions de stress systémiques dans E. coli 20, mais peut modifier les modèles de transcription indirectement. Alternativement, les marqueurs de la GFP ou de résistance à l'ampicilline inclus sur le phagémide peuvent concourir pour les ressources cellulaires, ce qui réduit l' expression mKate2 et la croissance 9. Enfin, la cassette elle-même ARNs peut modifier globalement les profils d'expression génique en dosant la protéine Hfq ou par le biais hors cible de l'ARNm silençage. Effets cibles Off sont fréquents dans l' ARNi in vivo ciblant 21-23, mais ils doivent encore être systématiquement étudiées pour ce système.
Une limitation de cette méthode est que les effi d'infectioncacité est inférieure à 100%, ce qui permet certaines bactéries non infectées à persister dans la population. Les résultats de ces travaux et les travaux antérieurs 10 suggèrent que les cellules non infectées représentent 1-10% de la population finale, et sont responsables de la plupart des phénotypes nonsilenced observées. Une variété de routes à M13-résistance sont connus, avec la perte étant mutationnelle la plus courante de l' expression des pili 24. À la lumière de ces limitations, les contrôles doivent être utilisés pour confirmer les taux d'infection élevés et l'efficacité knockdown.
Une autre limite potentielle pour certaines applications est le transfert occasionnel de contamination phage auxiliaire. Bien que M13K07 contient un signal d'encapsidation muté, il peut être encapsidé dans la capside du phage à basse fréquence et transféré dans les populations infectées, ce qui entraîne des cellules compétentes pour la production de phage et la propagation continue de phages au – delà de l'événement d'infection initiale 25. Les modifications apportées au phage auxiliaire ont prouvé leur efficacitéà la réduction des emballages non spécifiques, bien que parfois au détriment de la production de phage réduite 26.
Bactériophage Engineered sont devenus un outil indispensable pour E. biologie synthétique coli, permettant une livraison rapide de nouveaux gènes à une population croissante. Des travaux récents ont produit des circuits de communication intercellulaire 11 ou exprimé des facteurs de transcription pour supprimer la résistance aux antibiotiques voies 27. Le protocole présenté ici ajoute à une collection croissante d'outils qui permettent le contrôle de la physiologie bactérienne par ARNs programmées. Nucléases CRISPR-Cas, lorsqu'ils sont mutés pour éliminer l' activité nucléase, ont été montré pour réprimer la transcription sur des cibles de gènes ARN-guidée 17,28. En revanche, les ARNs silençage fonctionne au niveau de translation et ne nécessite pas l'expression de protéines exogènes. biotechnologies de nouvelle génération peuvent unir le contrôle de la transcription et de la traduction avec la livraison de phage médiée programmer phéno complexetypes en temps réel.
The authors have nothing to disclose.
Le financement de ce travail a été fourni par la Fondation Bettencourt Schueller à l'appui de l'équipe de Paris Bettencourt iGEM. Nous remercions l'unité de recherche de U1001 INSERM et Chantal Lotton pour l'assistance technique et des conseils. Phagémide Litmus28i_J23115-B0032-GFP a été fourni par Monica Ortiz et Drew Endy de Stanford.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |