We describe a method to knock down gene expression in a growing population of E. coli cells using sequence-targeted sRNA expression cassettes delivered by an M13 phagemid vector.
RNA-vermittelte Niederschläge werden weithin zur Kontrolle der Genexpression verwendet. Diese vielseitige Familie von Techniken macht Gebrauch von kurzen RNA (sRNA), die mit jeder Sequenz synthetisiert werden kann, und gestaltet jedes Gen für silencing gezielt zu ergänzen. Weil sRNA Konstrukte können direkt auf vielen Zelltypen eingeführt werden, oder eine Vielzahl von Vektoren verwenden, können die Genexpression in lebenden Zellen ohne aufwendige genetische Veränderung unterdrückt werden. Die häufigste RNA Knockdown-Technologie, RNA-Interferenz (RNAi), nutzt die endogene RNA-induzierten Silencing-Komplex (RISC) -Sequenz Erkennung und Spaltung der Ziel-mRNA zu vermitteln. Anwendungen dieser Technik sind daher auf RISC-exprimierenden Organismen beschränkt ist, in erster Linie Eukaryoten. Vor kurzem haben eine neue Generation von RNA Biotechnologen alternative Mechanismen entwickelt, die für die Genexpression durch RNA steuern und so möglich, die RNA-vermittelte Gen in Bakterien hergestellt Niederschlägen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Schweigen zu bringen Gen Expression in E. coli , die funktionell ähnlich RNAi. In diesem System wird ein synthetisches Phagemid wurde entwickelt sRNA auszudrücken, die entworfen können eine beliebige Sequenz abzuzielen. Das Expressionskonstrukt ist auf eine Population von E. zuge coli – Zellen mit nicht-lytische Phage M13, wonach es in der Lage ist , in stabiler Weise als ein Plasmid replizieren. Antisense – Ansatz und silencing der Ziel – mRNA durch die Hfq Protein endogen E. vermittelter coli. Dieses Protokoll umfasst Methoden für die Gestaltung der Antisense sRNA, die Konstruktion des Phagemid-Vektor, Verpackung des Phagemid in M13-Bakteriophagen, eine Live-Zellpopulation für eine Infektion der Vorbereitung und Durchführung der Infektion selbst. Das fluoreszierende Protein mKate2 und das Antibiotikaresistenz-Gen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) sind gezielte repräsentative Daten zu generieren und Zuschlags Wirksamkeit zu quantifizieren.
RNA-vermittelte Gen-Knockdowns gehen in zwei Stufen. Zunächst wird ein RNA-Molekül zu einer Zelllinie oder eines Organismus der Studie eingeführt. Zweitens endogene RNA-bindende Proteine RNA-Zielerkennung erleichtern und die Dämpfungswirkung erzeugen. Alle RNA-Technologien profitieren Knockdown von der anpassbaren Natur des synthetischen sRNAs, die leicht ein bestimmtes Ziel von Interesse übereinstimmen hergestellt werden können. Allerdings variieren die molekularen Details der RNA-Aufnahme und silencing weit über Modellsystem beschränke wo und wie RNA Niederschlägen angewendet werden kann.
In Nematoden, doppelsträngige Moleküle RNA (dsRNA) in den Medien direkt oder durch die Würmer mit einer Bevölkerung von dsRNA-exprimierenden E. Fütterung coli – Zellen 1,2. In Drosophila kann RNAi 3 durch Mikroinjizieren Embryonen mit dsRNA erreicht werden, oder in Zelllinien durchgeführt , indem einfach dsRNA zu dem Kulturmedium 4 hinzugefügt wird . In Säugetierzelllinien,synthetischen small interfering RNAs (siRNAs) an lebenden Zellen durch Elektroporation 1,2,5, verpackt in Liposomen 3,6, oder ausgedrückt von DNA – Plasmid – Vektoren 4,7 geliefert werden. Sobald die RNA-Spezies in das Cytosol erreicht, stützt sich die RNAi-Weg auf der RISC-Komplex dsRNA zu verarbeiten, erleichtern Antisense Erkennung des Ziels und katalysieren translationale Repression Abbau mRNA oder Heterochromatinbildung, auf dem Host abhängt.
Aufgrund dieser Anforderungen können klassische RNAi nur in Organismen durchgeführt werden, die effizient exogene RNA aufnehmen und exprimieren RISC oder eine RISC-ähnliche Aktivität. Bemerkenswert ist , schließt dies das Modell Bakterium E. coli, die das RNAi – Weg fehlt. die jüngsten Fortschritte in der synthetischen Biologie bieten jedoch die Werkzeuge sowohl das Lieferproblem und das Silencing Problem zu lösen.
In diesem Protokoll werden sRNA – Konstrukte in E. ausgedrückt coli aus einer DNA – Vektor geliefert living Zellen des M13 Phagemid / Helfer-System. Ein Phagemid ist jedes Plasmid mit einem Phagen abgeleitete f1-Replikationsursprung. Ein Helferplasmid, in diesem Fall M13KO, trägt die alle Maschinen Viruspartikel zu produzieren erforderlich, ist aber selbst nicht zuständig für die Replikation und Verpackung. Wenn ein Phagemid und Helferplasmid werden co-transformiert, haftet allein der Phagemid an der f1-Ursprung repliziert, verpackt und ausgeschieden werden. Die vektorisiert Phagemid ist dann zuständig Live E. zu infizieren coli über das F – Pilus.
In diesem System wird der Schalldämpfungseffekt durch individuelle sRNA Kassetten Kombinieren einer Gerüstsequenz mit einem Target-Bindungssequenz erzeugt wird. Die Zielbindungssequenz ist 24 Basenpaare Antisense-mRNA zu einem Ziel, typischerweise an der Ribosomenbindungsstelle (RBS). Die Gerüstsequenz, entwickelt von Na und Kollegen 8 enthält eine Hfq-Bindungsmotiv aus micc extrahiert, eine kleine regulatorische RNA endogenen E. coli. Die Hfq Protein stimuliert RNA-RNA Binding und mRNA Degradation, eine Rolle in diesem System ähnlich RISC in RNAi dient. 1 zeigt ein komplettes System für den Phagen-vermittelter sRNA Niederschläge, inklusive der sRNA Kassettenstruktur, Phagemid Vektorisierung und Silencing – Mechanismus.
Als ein Verfahren der Genexpression in E. modulieren coli, ist sRNA Silencing einfach, schnell und vielseitig. Die gezielte E. coli ist nicht über Ausbreiten des Phagemid und Expression des sRNA belastet. Dies kann im Rahmen der synthetischen Biologie oder der Grundlagenforschung in denen die Expression von größeren heterologe Konstrukte belasten können zelluläre Ressourcen 9 relevant sein. Phagemide mit neuen Ziele können mit einem einzigen PCR und geerntet einen Tag nach Phagemid Transformation hergestellt werden. Schließlich kann nahezu jede mRNA gerichtet werden. Die sRNA – Regulationskassette (auf einem Standard – Plasmid) wurde auf einer Vielzahl von Zielen in den Stoffwechsel mit typischen Repression Ebenen> 90% 8 zu arbeiten , gezeigt.
<p class = "jove_content"> Dieses Protokoll reproduziert und erweitert auf früheren Arbeiten mit Phagemid geborene sRNA 10 Kassetten. Zuerst wird eine verpackte Phagemid zu einer Batch – Kultur von E. eingeführt coli Zellen und verwendete Ausdruck des fluoreszierenden Proteins mKate2 zum Schweigen zu bringen. Nachfolgende Fluoreszenzänderungen werden in Echtzeit überwacht. Zweitens Klopfen nach unten das CAT-Gen wird gezeigt, auf Agarplatten phänotypischen Resistenz gegen Chloramphenicol zu reduzieren. In beiden Fällen führt das Phagemid selbst ein GFP-Marker, so dass Infektionsrate unabhängig von der Zuschlagseffizienz gemessen werden.Das vorliegende Verfahren erreicht 80% ige Reduktion der mKate Fluoreszenzwerte im Vergleich zu ungezielte Kontrollen. Dies steht im Einklang mit anderen RNA – Knockdown – Methoden, bei denen das gesamte Silencing wird nicht beobachtet und 50-90% Wirkungsgrad ist typisch 16,17. Auf der phänotypischen Ebene CAT-bezogene Niederschläge konnten deutlich Chloramphenicol-Resistenz zu dämpfen, und beseitigen es unter bestimmten Bedingungen.
Der Zuschlag Phänotyp war nach nur wenigen Stunden nach der Infektion (3B) auf Bevölkerungsebene nachweisbar. Dies stellt ein wichtiges Merkmal des Phagen-basierten Delivery: kann eine hohe Zuschlags Frequenz ohne vorherige genetische Modifikation direkt in Batch-Kultur erhalten werden. Im Gegensatz zu herkömmlichen Modifikationen genetischen Plasmidtransformation oder genomische Integration verwenden, wird Phageninfektion nicht verlangen, dass eine Population von einer einzelnen isolierten Kolonie wieder angebaut werden. Dadurch können die Auswirkungen von Phageninfektion zu sein explored in Populationen mit komplexen räumlichen Dynamik 11, mit bereits bestehenden räumlichen Strukturen wie Biofilme 18 oder in genetisch gemischten natürlichen Populationen 19.
Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren ist die Herstellung von verpackten Phagemiden bei hohen Titer. Die metabolische Belastung mit Phagenteilchens Produktion verbunden sind, können in dem Phagemid Produktionsstamm zu hohen Mutationsraten oder Plasmid-Verlust führen. Es wird empfohlen, die Phagemid Produktionsstamm direkt aus einer einzigen cotransformiert Kolonie und nicht gekühlt, gefroren oder Unter kultiviert Phagen Ernte vor kultiviert werden. Eine geringe Effizienz der Co-Transformation kann auch beobachtet werden , wenn die Phagemid und Helferplasmid E. Einführung gleichzeitig coli. In diesem Fall können höhere Wirkungsgrade durch Transformieren des ersten Helferplasmid erhalten werden, dann kompetente Zellen Herstellung des Helferplasmid für die nachfolgende Transformation mit dem Phagemid trägt.
Phagemid Infektion oder sRNA Expression erlegt auch eine nachweisbare metabolische Belastung auf den Zielzellen und in einigen phänotypischen Störungs führen kann. Zum Beispiel wurde eine Verringerung der mKate2 Fluoreszenz beobachtet , selbst wenn die Zellen mit einem Phagemid – Targeting – CAT (Abbildung 3) infiziert waren. Eine Infektion mit M13 ist nicht daran gedacht , systemische Stressreaktionen in E. auslösen 20 coli, kann aber indirekt Transkriptionsmuster verändern. Alternativ kann das GFP oder Ampicillin – Resistenzmarker auf dem Phagemid enthalten für zellulare Ressourcen konkurrieren, wodurch mKate2 Expression und das Wachstum 9. Schließlich Genexpressionsprofile verändern die sRNA Kassette selbst global durch das Hfq Protein Titrieren oder durch Off-Target-mRNA-Silencing. Aus Zielwirkungen sind häufig in in vivo RNAi – Targeting 21-23, aber sie haben noch systematisch für dieses System untersucht werden.
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Infektion effizienz ist weniger als 100%, einige nicht-infizierten Bakterien ermöglicht in der Bevölkerung zu persistieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit und frühere Arbeit 10 deuten darauf hin , dass nicht infizierte Zellen 1-10% der Gesamtbevölkerung ausmachen, und sind verantwortlich für die meisten der nonsilenced Phänotypen beobachtet. Eine Vielzahl von Routen zu M13-Resistenz sind bekannt, mit dem die gängigste Mutations – Verlust von Pilus Ausdruck 24. In Anbetracht dieser Beschränkungen sollten Kontrollen verwendet werden, um hohe Infektionsraten und Zuschlags Effizienz zu bestätigen.
Eine weitere potentielle Beschränkung für einige Anwendungen ist die gelegentliche Übertragung von Helferphagen zu kontaminieren. Obwohl M13K07 ein mutiertes Verpackungssignal enthält, kann es auf infizierte Populationen bei niedriger Frequenz und übertragen verpackt in Phagen Kapsid werden, was in Zellen kompetent für die Phagenproduktion und die fortgesetzte Ausbreitung der Phagen über die anfängliche Infektionsereignis 25. Änderungen an der Helferphage haben sich bewährtbei unspezifischen Verpackungs Verringerung, wenn auch manchmal auf Kosten einer reduzierten Phagenproduktion 26.
Ausgeführt Bakteriophagen sind zu einem unverzichtbaren Werkzeug für E. geworden coli synthetischen Biologie ermöglicht die schnelle Bereitstellung neuer Gene zu einer wachsenden Bevölkerung. Neuere Arbeiten haben 11 interzellulären Kommunikationsschaltungen erzeugt oder Transkriptionsfaktoren ausgedrückt Antibiotika – Resistenz zu unterdrücken Pfade 27. Das Protokoll vorgestellt fügt hier zu einer wachsenden Sammlung von Werkzeugen, die durch programmierte RNAs Kontrolle der bakteriellen Physiologie ermöglichen. CRISPR-Cas Nukleasen, wenn sie mutiert Nukleaseaktivität zu beseitigen, wurden Transkription 17,28 an RNA-geführten Genziele zu verdrängen gezeigt. Im Gegensatz dazu arbeitet sRNA silencing auf der Translationsebene und erfordert keine exogenen Protein-Expression. Next-Generation Biotechnologien können Transkriptions- und Translationskontrolle mit dem Phagen-vermittelte Abgabe vereinen komplexe Phänotypen zu programmierenTypen in Echtzeit.
The authors have nothing to disclose.
Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von der Fondation Bettencourt Schueller zur Unterstützung der Pariser Bettencourt iGEM-Team zur Verfügung gestellt. Wir danken dem INSERM U1001 Forschungseinheit und Chantal Lotton für technische Hilfe und Beratung. Phagemid Litmus28i_J23115-B0032-GFP wurde von Monica Ortiz und Drew Endy von der Stanford zur Verfügung gestellt.
Plasmid Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
DpnI Enzyme | NEB | R0176S | |
Phusion High Fidelity Polymerase | NEB | M0530S | |
Taq 2x Master Mix | NEB | M0270L | |
M13KO7 Helper Phage | NEB | N0315S | |
DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
TOP10F' Cells | Life Technologies | C3030-03 | |
LB Broth | Sigma | L3022-250G | |
Ampicillin | Sigma | A9393-5G | |
Kanamycin | Sigma | 60615-5G | |
Chloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G |