Imagerie Ratiométrique du pH extracellulaire dans biofilms dentaires
Summary
Un colorant ratiométrique sensible au pH est utilisé en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et l'analyse d'image numérique pour contrôler le pH extracellulaire dans les biofilms dentaires en temps réel.
Abstract
Le pH dans les biofilms bactériens sur les dents est d'une importance centrale pour la carie dentaire, une maladie avec une prévalence mondiale élevée. Les nutriments et métabolites ne sont pas répartis uniformément dans les biofilms dentaires. Une interaction complexe de sorption à et de la réaction avec la matière organique dans le biofilm réduit les chemins de diffusion de solutés et crée des pentes raides de molécules réactives, y compris les acides organiques, à travers le biofilm. méthodes microscopiques fluorescentes quantitatives, comme la vie de l'imagerie de fluorescence de temps ou pH ratiometry, peuvent être utilisés pour visualiser le pH dans différents microenvironnements de biofilms dentaires. pH ratiometry exploite un décalage dépendant du pH dans l'émission de fluorescence des colorants sensibles au pH. Calcul du rapport d'émission à deux longueurs d'onde différentes permet de déterminer le pH local dans les images microscopiques, quelle que soit la concentration du colorant. Contrairement à microélectrodes la technique permet de surveiller les deux gradients verticaux et horizontaux pH en temps réel avecperturber mécaniquement le biofilm. Cependant, il faut prendre soin de différencier précisément entre les compartiments extra- et intracellulaires du biofilm. Ici, le colorant ratiométrique, seminaphthorhodafluor-4F 5- (et-6) acide carboxylique (C-SNARF-4) est utilisé pour contrôler le pH extracellulaire in vivo biofilms dentaires cultivés de la composition des espèces inconnues. Lors de l'exposition au glucose est le colorant jusqu'à concentré à l'intérieur de toutes les cellules bactériennes dans les biofilms; elle est donc utilisée à la fois comme une tache bactérienne universelle et comme marqueur du pH extracellulaire. Après l'acquisition de l'image microscopique confocale, la biomasse bactérienne est retiré de toutes les images en utilisant le logiciel d'analyse d'image numérique, qui permet de calculer exclusivement pH extracellulaire. pH ratiometry avec le colorant ratiométrique est bien adapté pour étudier le pH extracellulaire dans minces biofilms allant jusqu'à 75 um d'épaisseur, mais est limitée à la plage de pH entre 4,5 et 7,0.
Introduction
Le procédé décrit ici permet de surveiller le pH extracellulaire dans les biofilms dentaires dans la plage comprise entre 4,5 et 7, en utilisant le colorant ratiométrique seminaphthorhodafluor-4F 5- (et-6), acide carboxylique (C-SNARF-4) en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et l'analyse d'image numérique. Le colorant fluorescent utilisé est sensible au pH et affiche un changement dans son émission de fluorescence en fonction de l'état de protonation. L'émission de fluorescence des pics moléculaires protonés à 580 nm et l'émission de la molécule déprotonée 1 à 640 nm. Le rapport des intensités d'émission de fluorescence dans deux fenêtres de détection comprenant deux pics d'émission (576-608 nm et 629-661 nm) reflète ainsi le pH dans la phase liquide, quelle que soit la concentration de colorant. Avec un pKa de 6,4 ~ le colorant est adapté pour visualiser le pH dans un environnement modérément acides.
PH dans les biofilms bactériens est d'une importance capitale pour tous les processus métaboliques.Dans le cas des biofilms dentaires, le pH dans la matrice extracellulaire est le facteur de virulence essentiel pour le développement des caries dentaires. Des périodes prolongées de faible pH à l'interface biofilm-dent conduit à ralentir la déminéralisation de l'émail sous – jacent 2. Grâce à l'architecture tridimensionnelle complexe de biofilms, des métabolites, y compris les acides organiques, ne sont pas répartis uniformément à travers le biofilm. Hautement et moins microenvironnements acidogènes se trouvent dans la proximité spatiale étroite 3.
Depuis des décennies, des gradients de pH verticaux dans les biofilms ont été enregistrées à l'aide de micro – électrodes 4-6. Bien qu'ils offrent une bonne résolution spatiale en raison de leur petite taille de la pointe, ils ne sont pas bien adaptés pour surveiller les gradients horizontaux. En outre, l'insertion de l'électrode perturbe le biofilm mécaniquement. techniques microscopiques fluorescentes quantitatives offrent l'avantage de visualiser les changements de pH dans différentes zones d'un biofilm sans interférer mécaniquence. Champs microscopiques de vue différents peuvent être choisis librement et imagées de manière répétée sur des périodes prolongées 1,7-9. Cependant, lors de l'interprétation des images microscopiques biofilm, il est important de faire la distinction entre la fluorescence provenant de la biomasse microbienne et de la fluorescence provenant de l'espace extracellulaire. Dans des conditions acides, le pH à l' intérieur des cellules bactériennes est différent du pH dans la matrice extracellulaire, comme les bactéries transportent activement des protons à travers la membrane cellulaire , au détriment de l' adénosine triphosphate 10. Dans le contexte de la carie dentaire, le pH intracellulaire des bactéries n'a pas un impact direct sur l'émail sous-jacent alors qu'une faible pH extracellulaire conduit à la déminéralisation. Étalement pH dans des images microscopiques qui contiennent à la fois des zones exemptes de bactéries et les bactéries conduit à des résultats erronés. L'utilisation d'autres tâches ainsi que le colorant sensible au pH pour visualiser la biomasse bactérienne et de différencier entre les régions extra- et intracellulaires apporte able risque de contamination fluorescente de l'espace extracellulaire et des erreurs de mesure 11.
Le présent manuscrit décrit donc l'utilisation du colorant ratiométrique dans une double fonction; à la fois en tant que marqueur de pH et comme une tache bactérienne universelle. Comme le colorant est mis concentré dans des cellules bactériennes, la combinaison d'imagerie microscopique confocale et une procédure d'analyse d'image numérique précis permet la détermination du pH extracellulaire dans la plage comprise entre 4,5 et 7,0 dans les biofilms minces dentaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
La surveillance microscopique du biofilm pH offre plusieurs avantages par rapport à l' électrode ou microélectrode mesures 4-6. techniques microscopiques permettent de déterminer le pH avec une haute résolution spatiale et permettre la capture des gradients de pH à la fois horizontale et verticale dans les biofilms sans perturber le biofilm mécaniquement. Les tentatives précédentes de surveillance du pH microscopique, cependant, omis de faire la différence entre le pH extracellulaire et intracel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Javier E. Garcia et Lene Grønkjær d'assistance technique et Merete K. Raarup pour des discussions fructueuses. Ce travail a été financé par la Fondation de recherche de l'Université d'Aarhus et de la Simon Spies Foundation.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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