치과 바이오 필름에 세포 외 pH를 비례 영상
Summary
pH 민감성 염료 비율 적 실시간 치과 생물막의 세포 외 pH를 모니터링하는 공 초점 레이저 주사 현미경, 디지털 화상 분석과 조합하여 사용된다.
Abstract
치아에 세균 바이오 필름의 pH는 충치, 높은 전 세계적으로 유병률과 질병에 대한 중앙 중요하다. 영양 및 대사 산물은 치과 바이오 필름에 균일하게 분포되지 않습니다. 바이오 필름의 유기 물질과에 흡착 및 반응의 복잡한 상호 작용은 용질의 확산 경로를 줄이고 바이오 필름을 통해, 유기산을 포함하여 반응성 분자의 가파른 경사를 만듭니다. 이러한 형광 수명 이미징 또는 산도 ratiometry 정량적 형광 현미경 방식은 치과 생물막 상이한 미세 환경에서의 pH를 시각화하는데 이용 될 수있다. 산도 ratiometry는 pH 민감성 염료의 형광 방출의 pH에 따라 변화를 이용한다. 두 개의 서로 다른 파장에서 방출 비율의 계산에 관계없이 염료의 농도, 미세한 이미지의 로컬의 pH를 결정 허용한다. 실시간에서 수직 및 수평의 pH 구배를 모니터링 허용 기법을 미소 전극 반대로아웃 기계적으로 바이오 필름을 방해. 그러나주의 바이오 필름의 역외 및 세포 내 구획 사이에 정확하게 구분하기 위해주의해야한다. 여기서, 비율 적 색소 seminaphthorhodafluor-4F -5- (및 -6) 카르 복실 산 (C-가 SNARF-4)는 알 수없는 종류의 조성물의 생체 내 성장 치과 생물막의 세포 외 pH를 모니터링하는데 사용된다. 염료를 포도당에 노출시까지 농축 생물막의 모든 박테리아 세포 안에; 그것은 따라서 보편적 인 세균 오염으로와 세포 외 pH를 마커로 모두 사용된다. 공 촛점 현미경 이미지 획득 후, 균체 매스 독점적 세포의 pH를 계산하도록 허용하는 디지털 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지로부터 제거된다. 비율 계량 염료의 pH ratiometry 최대 75 μm의 두께의 얇은 생물막에서 세포 외 pH가 공부를 잘 적합하지만, 4.5 및 7.0 사이의 pH 범위로 제한됩니다.
Introduction
여기에 설명 된 방법은 비율 적 색소 (및 -6) 카르 복실 산 (C-SNARF-4) 공 초점 레이저 주사 현미경과 결합하고 seminaphthorhodafluor-4F -5-을 사용하여 4.5 내지 7의 범위 치과 생물막의 세포 외 pH를 모니터링 허용 디지털 이미지 분석. 사용되는 형광 염료는 pH에 민감하고 양성자의 상태에 따라 그 형광 방출의 변화를 표시합니다. 580 nm에서의 양성자 분자 피크 발광 형광체 및 640 nm의 1로 탈 분자의 방출. 두 개의 방사 피크를 포함하는 두 개의 검출 창에서 형광체 발광 강도의 비는 (576 – 608 nm의 629-661 나노 미터)는 이에 관계없이 염료의 농도, 액상의 pH를 반영한다. ~ 6.4의 약동학와 염료 적당히 산성의 pH 환경에서 시각화하는 것이 적합하다.
세균 바이오 필름의 PH는 모든 대사 과정에 대한 중앙 중요하다.치과 생물막의 경우, 세포 외 기질의 pH는 우식의 개발을위한 중요한 독성 인자이다. 생물막 치아 인터페이스 리드에서 낮은 pH와 연장 기간은 기본 에나멜 2의 탈회 속도가 느려질 수 있습니다. 때문에 유기산을 포함하여 생물막, 대사 산물의 복잡한 3 차원 구조로, 균일 바이오 필름에 분산되지 않습니다. 매우 적은 acidogenic 미세 환경은 가까운 공간 근접 3에서 찾아 볼 수있다.
수십 년 동안, 바이오 필름에 수직의 pH 구배는 마이크로 전극 4-6의 도움으로 기록되었다. 그들은 그들의 작은 팁 크기에 좋은 공간 해상도를 제공하지만, 그들은 수평 기울기를 모니터에 적합하지 않습니다. 또한, 상기 전극 삽입 기계적 생물막을 방해. 정량적 형광 현미경 기술은 기계적 간섭없이 생물막의 다른 영역에서의 pH 변화를 시각화하는 장점을 제공한다NCE. 보기의 다른 미세한 필드를 자유롭게 선택하여 장시간 1,7-9에 걸쳐 반복적으로 이미지화 할 수있다. 현미경 생물막 화상 해석하지만,이 세포 외 공간으로부터 도출 미생물 바이오 매스로부터 유래 형광 형광을 구별하는 것이 중요하다. 박테리아 적극적 아데노신 삼인산 (10)의 비용들이 세포막을 가로 질러 양성자를 수송 산성 조건에서 균체 내부 pH는 세포 외 기질의 pH가 다르다. 낮은 세포 외 pH를 탈회 리드 반면 우식의 맥락에서, 박테리아 세포 내 pH는 기본 에나멜에 직접적인 영향을 미치지 않는다. 박테리아가없는 지역과 박테리아를 모두 포함 현미경 이미지에서 pH가 평균하면 잘못된 결과로 이어집니다. 세균 바이오 매스를 시각화하고 역외 및 세포 내 영역을 구분하기 위해 pH 민감성 염료와 함께 다른 얼룩의 사용은 AB을 제공합니다세포 외 공간의 형광 오염과 거짓 측정 (11)의 위험 아웃.
본 원고 따라서 이중 기능에 대해 비율 염료의 사용을 설명한다; pH를 마커로하고 보편적 인 박테리아 얼룩 등 모두. 염료 균체 농축 업 바와 같이, 공 초점 현미경 영상의 조합 정확한 디지털 영상 분석 방법은 얇은 치과 생물막 4.5 내지 7.0 범위 내에서 세포 외 pH를 판정 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
전극 또는 미세 측정 4-6에 비해 생물막의 pH 현미경 모니터링은 몇 가지 장점을 제공한다. 현미경 기술은 높은 공간 분해능으로 pH를 확인하고 기계적으로 바이오 필름을 방해하지 않고 생물막에서 수평 및 수직 모두의 pH 구배를 캡처 할 수 있도록 허용합니다. 미세한 pH 검사의 이전 시도는, 그러나, 바이오 필름 1,7,9에서 세포와 세포 내 pH를 구별하지 못했습니다. 때문에 세균…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 유익한 토론 하비에르 E. 가르시아와 기술 지원 레네 키에르 및 Merete K. Raarup에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 오르후스 대학 연구 재단에 의해 자금을 지원하고, 사이먼 재단 스파이.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Hunter, R.C., & Beveridge, T.J. Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 71 (5), 2501-2510 (2005).
- Takahashi, N., & Nyvad, B. Caries ecology revisited: microbial dynamics and the caries process. Caries Res. 42 (6), 409-418 (2008).
- Schlafer, S. et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PLoS.One. 6 (9), e25299 (2011).
- von Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Appl. Environ. Microbiol. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Revsbech, N.P. Analysis of microbial communities with electrochemical microsensors and microscale biosensors. Methods Enzymol. 397 147-166 (2005).
- Vanhoudt, P., Lewandowski, Z., & Little, B. Iridium oxide pH microelectrode. Biotechnol. Bioeng. 40 (5), 601-608 (1992).
- Franks, A.E. et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy & Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- Hidalgo, G. et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Appl. Environ. Microbiol. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J.M. et al. Depth penetration and detection of pH gradients in biofilms by two-photon excitation microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 65 (8), 3502-3511, (1999).
- Bender, G.R., Sutton, S.V., & Marquis, R.E. Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPases of oral streptococci. Infect. Immun. 53 (2), 331-338, (1986).
- Schlafer, S. et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms using C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81(4):1267-73 (2015).
- Dige, I., Nilsson, H., Kilian, M., & Nyvad, B. In situ identification of streptococci and other bacteria in initial dental biofilm by confocal laser scanning microscopy and fluorescence in situ hybridization. Eur. J Oral Sci. 115 (6), 459-467 (2007).
- de Jong, M.H., van der Hoeven, J.S., van OS, J.H., & Olijve, J.H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Appl. Environ. Microbiol. 47 (5), 901-904, (1984).
- Daims, H., Lucker, S., & Wagner, M. daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environ. Microbiol. 8 (2), 200-213 (2006).
- Liu, Y.L., Nascimento, M., & Burne, R.A. Progress toward understanding the contribution of alkali generation in dental biofilms to inhibition of dental caries. Int. J Oral Sci. 4 (3), 135-140 (2012).
