Imaging radiométrica de pH extracelular en los biofilms dentales
Summary
Un colorante radiométrica sensible al pH se usa en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis digital de imágenes para monitorizar el pH extracelular en biofilms dentales, en tiempo real.
Abstract
El pH en las biopelículas bacterianas en los dientes es de importancia central para la caries dental, una enfermedad con una alta prevalencia en todo el mundo. Los nutrientes y metabolitos no se distribuyen uniformemente en las biopelículas dentales. Una compleja interacción de sorción para y la reacción con la materia orgánica en la biopelícula reduce los caminos de difusión de solutos y crea gradientes empinados de moléculas reactivas, incluyendo ácidos orgánicos, a través de la biopelícula. métodos microscópicos fluorescentes cuantitativos, tales como formación de imágenes tiempo de vida de fluorescencia o ratiometry pH, se pueden emplear para visualizar pH en diferentes microambientes de biofilms dentales. ratiometry pH explota un cambio dependiente del pH en la emisión fluorescente de los colorantes sensibles al pH. Cálculo de la relación de emisión a dos longitudes de onda diferentes permite determinar pH local en imágenes microscópicas, independientemente de la concentración del colorante. Contrariamente a la técnica de microelectrodos permite la monitorización ambos gradientes de pH verticales y horizontales, en tiempo real conperturbar mecánicamente el biofilm. Sin embargo, se debe tener cuidado para diferenciar con precisión entre los compartimentos extra e intracelulares de la biopelícula. Aquí, el colorante radiométrica, seminaphthorhodafluor 4F-5- (y 6) el ácido carboxílico (C-SNARF-4) se emplea para controlar el pH extracelular en vivo en los biofilms dentales cultivadas de la composición de especies desconocidas. Tras la exposición a la glucosa es el colorante concentrado hasta el interior de todas las células bacterianas en las biopelículas; se utiliza de este modo tanto como una mancha bacteriana universal y como un marcador de pH extracelular. Después de la adquisición de imagen microscópica confocal, la biomasa bacteriana se elimina de todas las imágenes utilizando software de análisis de imagen digital, que permite calcular exclusivamente pH extracelular. ratiometry pH con el colorante radiométrico es muy adecuado para estudiar pH extracelular en biofilms delgadas de hasta 75 m de espesor, pero está limitado al intervalo de pH entre 4,5 y 7,0.
Introduction
El método aquí descrito permite el seguimiento de pH extracelular en biofilms dentales en el intervalo entre 4,5 y 7, usando el colorante radiométrica seminaphthorhodafluor-4F 5- (y-6) ácido carboxílico (C-SNARF-4) en combinación con microscopía confocal de barrido láser y análisis de imagen digital. El colorante fluorescente empleado es sensible al pH y muestra un cambio en su emisión fluorescente en función del estado de protonación. La emisión fluorescente de los picos de moléculas protonadas en 580 nm, y la emisión de la molécula desprotonado a 640 nm 1. La relación de las intensidades de emisión fluorescente en dos ventanas de detección que comprende los dos picos de emisión (576-608 nm y 629-661 nm) refleja así pH en la fase líquida, con independencia de la concentración de colorante. Con un pK a de ~ 6,4 el colorante es adecuado para visualizar pH en ambientes moderadamente ácidas.
PH en las biopelículas bacterianas es de vital importancia para todos los procesos metabólicos.En el caso de biofilms dentales, pH en la matriz extracelular es el factor de virulencia clave para el desarrollo de la caries dental. Los períodos prolongados con un pH bajo en la interfaz de plomo-biopelícula dental para frenar la desmineralización del esmalte subyacente 2. Debido a la compleja arquitectura tridimensional de biofilms, metabolitos, incluyendo ácidos orgánicos, no se distribuyen uniformemente a través de la biopelícula. Altamente y menos microambientes acidogénicas se pueden encontrar en estrecha proximidad espacial 3.
Durante décadas, los gradientes de pH verticales en biofilms se registraron con la ayuda de microelectrodos 4-6. Mientras que ofrecen una buena resolución espacial debido a su pequeño tamaño de la punta, no son muy adecuados para controlar los gradientes horizontales. Por otra parte, la inserción del electrodo perturba el biofilm mecánicamente. Cuantitativos técnicas microscópicas fluorescentes ofrecen la ventaja de visualizar los cambios de pH en las diferentes áreas de un biofilm sin interferir mecánicana vez. Diferentes campos microscópicos de vista se pueden seleccionar libremente y la imagen varias veces durante periodos prolongados 1,7-9. Sin embargo, al interpretar imágenes microscópicas de biofilm, es importante distinguir entre la fluorescencia que deriva de la biomasa microbiana y la fluorescencia derivada del espacio extracelular. En condiciones ácidas, el pH dentro de las células bacterianas es diferente de pH en la matriz extracelular, como las bacterias transportan activamente protones a través de su membrana celular a expensas de trifosfato de adenosina 10. En el contexto de la caries dental, pH intracelular bacteriana no tiene un impacto directo sobre el esmalte mientras que subyacen bajo pH extracelular conduce a la desmineralización. Un promedio de pH en imágenes microscópicas que contienen ambas áreas y bacterias libres de bacterias conduce a resultados erróneos. El uso de otros a lo largo de las manchas con el colorante sensible al pH con el fin de visualizar la biomasa bacteriana y diferenciar entre las áreas extra e intracelulares trae abel riesgo de contaminación fluorescente del espacio extracelular y mediciones falsas 11.
Por consiguiente, la presente manuscrito describe el uso del colorante radiométrico en una doble función; tanto como un marcador de pH y como una mancha bacteriana universal. A medida que el tinte es up-concentra en las células bacterianas, la combinación de imágenes microscópicas confocal y un procedimiento de análisis de imagen digital precisa permite la determinación de pH extracelular en el intervalo entre 4,5 y 7,0 en las biopelículas dentales delgados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monitoreo microscópico de pH biofilm proporciona varias ventajas, en comparación con los electrodos o microelectrodos mediciones 4-6. técnicas microscópicas permiten determinar el pH con una alta resolución espacial y permitir la captura de gradientes de pH, tanto horizontales como verticales en biofilms sin perturbar el biofilm mecánicamente. Los intentos previos de monitoreo del pH microscópico, sin embargo, no pudieron diferenciar entre pH extracelular e intracelular en las biopelículas 1,7,9….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Javier E. García y Lene Grønkjær para la asistencia técnica y Merete K. Raarup para un debate fructífero. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus y la Fundación Simon Spies.
Materials
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A | |
| C-Apochromat 63X water immersion objective | Zeiss | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| SNARF-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| HEPES | Life Technologies | 11344-041 | |
| Costar 96-well black clear-bottom plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
| Custom-made glass slabs (4x4x1 mm; 1,200 grit) | Menzel | N/A | |
| Alginate impression material | GC Corporation | N/A | |
| Acrylic Adjusting Logic Sets/set of acrylic dental burs | Axis Dental | LS-906 | |
| Orthodontic retainer containers | Spark Medical Equipment Co., Ltd | SK-WDTC01 | |
| Sticky wax | Dentsply | N/A | |
| Chewing paraffin wax | Ivoclar Vivadent AG | N/A | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | Used during preparation of salivary solution |
| 0.45 µm and 0.2 µm syringe filters | Sigma Aldrich | CLS431220; CLS431219 | |
| daime | University of Vienna, Austria | http://dome.csb.univie.ac.at/daime | |
| ImageJ | NIH, Bethesda, Maryland, USA | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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