Summary

일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

Published: March 10, 2016
doi:

Summary

To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.

Abstract

우리는 개발 과정에서 조류 배아에 의해 영양소 이용률을 매개하는 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는 내배엽 상피 세포 배양 모델 (EEC)를 설립했다. 수정 된 일본어 메추라기 계란 5 일 동안 37 ° C에서 배양 한 다음 골목 막 (YSM)는 EEC 문화 시스템을 구축하기 위해 수집 노른자 하였다. 우리 YSM에서 배아 내배엽 층을 단리하고, (2) 내에 막 분리 – MM 3 개의 부분적으로 24 웰 배양 플레이트에 파종 전에게나로 분해. EECS는 조직에서 증식 및 세포 배양 연구를위한 준비가되어 있습니다. 우리는 EECS 예를 들어 생체 내에서 YSM의 일반적인 특성, 지질 방울의 축적, 스테롤 O-아실 트란스 퍼과 지단백 리파제의 발현을 한 것으로 나타났습니다. 부분 소화 치료는 크게 EEC 문화의 성공적인 속도를 증가했다. EECS을 활용, 우리는 SOAT1의 발현이 캠프 D에 의해 규제 것을 증명ependent 단백질은 관련 경로를 키나아제. 이 차 일본어 메추라기 EEC 문화 시스템은 배아 지질 수송을 연구하고 조류 배아 개발하는 동안 YSM 영양소 이용률을 매개에 관여하는 유전자의 역할을 명확히하기 위해 유용한 도구입니다.

Introduction

조류 배아의 주요 영양 자원이 33 % 지질, 17 %의 단백질로 구성 노른자, 1 % 재. 1 배아 개발 중입니다, 난황 막 (YSM)는 배아 복강 내에서 성장하고 점차적으로 노른자를 커버 표면. 배아 2 일에 시작하여, 지질 대사 및 혈관 신생과 관련된 유전자의 발현이 점차 YSM 증가되고 YSM 천천히 융모와 같은 돌기를 발생한다. -8,9- 이러한 돌기는 배아 발달을 지원하기 노른자 영양소의 흡수를 증가시킨다. YSM 세 가지 배엽, 내배엽, 중배엽과 외배엽을 포함하는 배외 (extraembryonic) 조직이다. (14) 난황 외배엽 부드럽게 난황을 포함하는 난황 막과 알부민 및 링크에 직면 해있다. 내배엽 상피 세포는 shap로 나눌 수있다 달걀 노른자를 향해 직접 직면하고 영양 활용 포털의 역할을한다. 6 YSM이 확장하면서, 내배엽 상피 세포 (EECS)를하고 있습니다두 그룹, 지역 난황 및 지역 vasculosa에 전자 및 기능을 제공합니다. (7)

영역 난황는 내배엽 세포로 구성되며 배아로부터 떨어진되고 영역 vasculosa는 중배엽 세포로 구성되고, 혈관 결합 조직으로 분화 EECS을 덮는다. 배아 5 일까지, 노른자는 완전히 YSM의 외배엽과 내배엽이 적용되고, 혈관 영역은 빠른 속도로 성장하고있다. YSM은 배아 순환 시스템으로 (노른자 유래 매우 저밀도 지질 단백질 등)과 단백질. 9, 2 따라서, 우리는 지질의 메커니즘을 연구하기 위해, 기본 일본어 메추라기 배아 내배엽 상피 세포 배양 시스템을 구축 recomposes 해제 지질 흡수 조류 배아 개발하는 동안 YSM에 활용.

예컨대 중성 지방, 레시틴, 인지질 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)와 같은 지질 조류 배아의 주 에너지 원이다. 개발의 초기 단계에서, 난황 지질 C는1.3 %의 CE의 omposed하고 조류 배아 발달 (3)의 중간 10-15 %로 상승, 11. 콜레스테롤 에스테르 조류 배아 YSM에 스테롤 O-아실 트랜스퍼 라제 1 (SOAT1)에 의해 콜레스테롤로부터 합성된다. (4)

콜레스테롤의 저장 형태는 CE, CE는 지질 단백질에 실시하고, 지질 단백질은 조직에 혈액 순환에 의해 수송된다. 13 주 해치 전에 조류 배아의 급속한 성장이있다. 약 노른자의 나머지 지질 함량의 68 %는이 단계에서 흡수된다. 10 지질 EEC 연구 모델로 정화 할 수있다 이용된다 노른자하는 메커니즘. 닭 EEC 배양 프로토콜은 본 연구의 목표를 ​​달성하기 위해 설립되었다. 2, 9, 그러나, 향상된 EEC 세포 배양 방법에 의해 영양분 활용도를 매개 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는데 필요한 조직 이식편의 낮은 성공률로 개발하는 동안 조류 배아.

Protocol

참고 :..이 절차는 등 바우어 등 2013 나카자와 등, 2011 년 2,9에 의해 개발 된 치킨 모델 문화 프로토콜의 수정입니다 1. 건강한 배아 5 일 태아 일본어 메추라기에서 준비 같은 케이지에서 함께 한 남자와 세 여성의 성적으로 성숙한 일본어 메추라기를 놓습니다. 전원 공급 및 임의 량의 물. 빛의 14 시간과 어둠의 10 시간에 동물 …

Representative Results

일관성 있고 유용한 셀 모델을 설정하는 목표를 달성하기 위해, 우리는 확장 증식 속도 및 조류 EECS의 성능을 안정화 할 필요가있다. 우리는 부분적 콜라겐 또는 콜라겐 플러스 디스 파제 0.6 U와 같은 단백질 분해 효소로 분해 내배엽 아니 효소 소화와 내배엽의 직접 배양을 비교 하​​였다. 디스 파제는 비극성 아미노산 잔기의 N 말단 펩티드 결합을 가수 분해 아미노 – ?…

Discussion

전 배양 시스템은 제한된 성공을 갖기 때문에, 더 배양 시스템이 필요하다. 일본 메추라기 YSM의 내배엽은 전 생체 내 외식의 더 나은 성장 성능을 달성하기 위해 세포 – 세포 접합을 완화하기 위해 콜라겐 등의 단백질 분해 효소와 치료가 필요합니다. 우리의 데이터는 부분 소화 처리에서 세포 수는 이일 (그림 1)에 대한 시딩 후 소화되지 않은 조직 문화에서보다 더 컸다 것으로 나타?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

현재 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 특히 국립 대만 대학, 대만 (부여 ID-104R350144)뿐만 아니라 대만의 과학 기술부 (부여 ID "상위 대학 계획에 대한 목표"에 의해 지원됩니다 MOST (104) -2313-B-002-039-MY3). 우리는 특히 현재의 연구를위한 동물 실 및 실험실 공간을 제공하기 위해 국립 대만 대학의 생명 공학 센터 감사합니다.

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco by Life technologies 12800-017 10 X 1 L For wash the EECs pellets
D-MEM/F-12 Gibco by Life technologies 12400-024 10 X 1 L As the basal medium in culturing EECs
NBCS Gibco by Life technologies 16010-159 As the supplyment serum in culturing EECs
Pen-Strep Ampho. Solution BI (Biological Industries) 03-033-1B 100ml For attenuating the possible infection 
Collagenase Type IV Gibco by Life technologies 17104-019 1g  Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue.
24 well plate FALCON® REF-353047 For EECs to attach and extension
50 ML PP centrifuge tubes Corning® CentriStarTM 430829 For transportion of membranes and enzyme digestion
50ML Conical bottomed Tube with Cap PRO TECH CT-50-PL-TW For transportion of membranes and enzyme digestion
Reciprocal shaking bath DEAGLE SB302 For better enzymatic digestion on membranes

References

  1. Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
  2. Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
  3. Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
  4. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
  5. Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
  6. Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
  7. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
  8. Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
  9. Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
  10. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
  11. Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
  12. Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
  13. Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
  14. Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
  15. . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
  16. Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
  17. Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).

Play Video

Cite This Article
Lin, H. J., Wang, S. H., Pan, Y. H., Ding, S. Primary Endodermal Epithelial Cell Culture from the Yolk Sac Membrane of Japanese Quail Embryos. J. Vis. Exp. (109), e53624, doi:10.3791/53624 (2016).

View Video