일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
우리는 개발 과정에서 조류 배아에 의해 영양소 이용률을 매개하는 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는 내배엽 상피 세포 배양 모델 (EEC)를 설립했다. 수정 된 일본어 메추라기 계란 5 일 동안 37 ° C에서 배양 한 다음 골목 막 (YSM)는 EEC 문화 시스템을 구축하기 위해 수집 노른자 하였다. 우리 YSM에서 배아 내배엽 층을 단리하고, (2) 내에 막 분리 – MM 3 개의 부분적으로 24 웰 배양 플레이트에 파종 전에게나로 분해. EECS는 조직에서 증식 및 세포 배양 연구를위한 준비가되어 있습니다. 우리는 EECS 예를 들어 생체 내에서 YSM의 일반적인 특성, 지질 방울의 축적, 스테롤 O-아실 트란스 퍼과 지단백 리파제의 발현을 한 것으로 나타났습니다. 부분 소화 치료는 크게 EEC 문화의 성공적인 속도를 증가했다. EECS을 활용, 우리는 SOAT1의 발현이 캠프 D에 의해 규제 것을 증명ependent 단백질은 관련 경로를 키나아제. 이 차 일본어 메추라기 EEC 문화 시스템은 배아 지질 수송을 연구하고 조류 배아 개발하는 동안 YSM 영양소 이용률을 매개에 관여하는 유전자의 역할을 명확히하기 위해 유용한 도구입니다.
Introduction
조류 배아의 주요 영양 자원이 33 % 지질, 17 %의 단백질로 구성 노른자, 1 % 재. 1 배아 개발 중입니다, 난황 막 (YSM)는 배아 복강 내에서 성장하고 점차적으로 노른자를 커버 표면. 배아 2 일에 시작하여, 지질 대사 및 혈관 신생과 관련된 유전자의 발현이 점차 YSM 증가되고 YSM 천천히 융모와 같은 돌기를 발생한다. -8,9- 이러한 돌기는 배아 발달을 지원하기 노른자 영양소의 흡수를 증가시킨다. YSM 세 가지 배엽, 내배엽, 중배엽과 외배엽을 포함하는 배외 (extraembryonic) 조직이다. (14) 난황 외배엽 부드럽게 난황을 포함하는 난황 막과 알부민 및 링크에 직면 해있다. 내배엽 상피 세포는 shap로 나눌 수있다 달걀 노른자를 향해 직접 직면하고 영양 활용 포털의 역할을한다. 6 YSM이 확장하면서, 내배엽 상피 세포 (EECS)를하고 있습니다두 그룹, 지역 난황 및 지역 vasculosa에 전자 및 기능을 제공합니다. (7)
영역 난황는 내배엽 세포로 구성되며 배아로부터 떨어진되고 영역 vasculosa는 중배엽 세포로 구성되고, 혈관 결합 조직으로 분화 EECS을 덮는다. 배아 5 일까지, 노른자는 완전히 YSM의 외배엽과 내배엽이 적용되고, 혈관 영역은 빠른 속도로 성장하고있다. YSM은 배아 순환 시스템으로 (노른자 유래 매우 저밀도 지질 단백질 등)과 단백질. 9, 2 따라서, 우리는 지질의 메커니즘을 연구하기 위해, 기본 일본어 메추라기 배아 내배엽 상피 세포 배양 시스템을 구축 recomposes 해제 지질 흡수 조류 배아 개발하는 동안 YSM에 활용.
예컨대 중성 지방, 레시틴, 인지질 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)와 같은 지질 조류 배아의 주 에너지 원이다. 개발의 초기 단계에서, 난황 지질 C는1.3 %의 CE의 omposed하고 조류 배아 발달 (3)의 중간 10-15 %로 상승, 11. 콜레스테롤 에스테르 조류 배아 YSM에 스테롤 O-아실 트랜스퍼 라제 1 (SOAT1)에 의해 콜레스테롤로부터 합성된다. (4)
콜레스테롤의 저장 형태는 CE, CE는 지질 단백질에 실시하고, 지질 단백질은 조직에 혈액 순환에 의해 수송된다. 13 주 해치 전에 조류 배아의 급속한 성장이있다. 약 노른자의 나머지 지질 함량의 68 %는이 단계에서 흡수된다. 10 지질 EEC 연구 모델로 정화 할 수있다 이용된다 노른자하는 메커니즘. 닭 EEC 배양 프로토콜은 본 연구의 목표를 달성하기 위해 설립되었다. 2, 9, 그러나, 향상된 EEC 세포 배양 방법에 의해 영양분 활용도를 매개 특정 효소와 단백질의 기능을 연구하는데 필요한 조직 이식편의 낮은 성공률로 개발하는 동안 조류 배아.
Protocol
Representative Results
Discussion
전 배양 시스템은 제한된 성공을 갖기 때문에, 더 배양 시스템이 필요하다. 일본 메추라기 YSM의 내배엽은 전 생체 내 외식의 더 나은 성장 성능을 달성하기 위해 세포 – 세포 접합을 완화하기 위해 콜라겐 등의 단백질 분해 효소와 치료가 필요합니다. 우리의 데이터는 부분 소화 처리에서 세포 수는 이일 (그림 1)에 대한 시딩 후 소화되지 않은 조직 문화에서보다 더 컸다 것으로 나타?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현재 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 특히 국립 대만 대학, 대만 (부여 ID-104R350144)뿐만 아니라 대만의 과학 기술부 (부여 ID "상위 대학 계획에 대한 목표"에 의해 지원됩니다 MOST (104) -2313-B-002-039-MY3). 우리는 특히 현재의 연구를위한 동물 실 및 실험실 공간을 제공하기 위해 국립 대만 대학의 생명 공학 센터 감사합니다.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
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