Japon Bıldırcın Embriyolar Yolk Sac Membran Primary Endodermal Epitel Hücre Kültürü
Summary
To study the mechanism of lipid utilization in yolk sac membranes during the late stages of avian embryonic development, we established a primary Japanese quail embryonic endodermal epithelial cell culture system.
Abstract
Biz gelişim sırasında kuş embriyolar tarafından besin kullanımı aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için bir Endodermal epitel hücre kültürü modeli (AET) kuruldu. Döllenmiş Japon bıldırcın yumurta 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edildi ve daha sonra SAC membranları (YSM) EEC kültür sistemi kurmak için toplandı sarısı edildi. Biz YSM embriyonik endoderm katman izole edilir ve 2'ye membran dilimlenmiş – 3 mm parçalar kısmen 24 oyuklu kültür plakaları içinde, tohumlamadan önce kollajenaz ile sindirilir. EECS dokusu içinde çoğalan ve hücre kültür çalışmaları için hazırdır. Bu EECS, örneğin, in vivo olarak YSM tipik özelliklerini, lipid damlaları birikimine, sterol O-asiltransferaz ve lipoprotein lipaz ekspresyonunu olduğu bulundu. Kısmi sindirim tedavisi önemli ölçüde AET kültürünün başarılı oranı arttı. EECS kullanarak, biz SOAT1 sentezlenmesi cAMP d düzenlenir olduğunu göstermiştirependent protein A ile ilgili yol kinaz. Bu birincil Japon bıldırcın EEC kültür sistemi embriyonik lipid ulaşım incelemek ve kuş embriyonik gelişim sırasında YSM besin kullanımını aracılık yer alan genlerin rolü açıklığa kavuşturmak için bir araçtır.
Introduction
Kuş embriyo önemli beslenme kaynağı% 33 lipit,% 17 protein oluşan sarısı, ve% 1 kül. 1 embriyo gelişimi sırasında, sarısı kese zarının (YSM) embriyonik karın boşluğu içinde yetişen ve yavaş yavaş sarısı kapsar yüzey. Embriyonik gün 2 başlayarak, lipit metabolizması ve anjiyojenez ile ilişkili gen ekspresyonu kademeli YSM artar ve YSM yavaş tüy benzeri çıkıntılar geliştirir. 8,9 Bu çıkıntılar embriyo gelişimini desteklemek için sarısı besin emilimini artırır. YSM üç germ katmanları, endoderm, mezoderm ve ektoderm içeren bir extraembryonic dokudur. 14 yolk kesesi ektoderm nazikçe sarısı kesesi kapsayacak şekilde vitellin membran ile albümin ve bağlantılar ile karşı karşıyadır. Endodermal epitel hücreleri Kadm bölünebilir yumurta sarısı doğru doğrudan karşı karşıya ve besin kullanım portalları olarak hizmet vermektedir. 6 YSM genişledikçe, Endodermal epitel hücre (EECS) vardırİki grup, bölge vitelline ve alan vaskulosa içine e ve işlevsellik. 7
Konum Vitellin endodermal hücrelerden oluşan ve embriyo uzak olmaktadır; Konum vaskulosa mezodermal hücrelerden oluşan ve kan damarları ve bağ dokuları ile farklılaştırılmış EECS kapsar. embriyonik gün 5 ile, yumurta sarısı tamamen YSM ve ektoderm ve endoderm ile kaplıdır ve vasküler alan hızla büyüdü. YSM embriyonik dolaşım sistemine (sarısı türetilen çok düşük yoğunluklu lipoprotein) ve proteinler. 9, 2 Bu nedenle, lipit mekanizmaları incelemek için, birincil Japon bıldırcın embriyonik endodermal epitel hücre kültür sistemi tesis yeniden oluşturur ve serbest bırakır lipidler, emer kuş embriyonik gelişim sırasında YSM içinde kullanımı.
Böyle triaçilgliserol, lesitin, fosfolipid ve kolesterol esteri (CE) olarak lipidler kuş embriyolar için birincil enerji kaynaklarıdır. gelişiminin erken aşamalarında, yumurta sarısı lipidler c vardırsadece% 1.3 CE omposed ve kuş embriyonik gelişim 3 orta vadede% 10-15 yükselir, 11. Kolesterol ester kuş embriyo YSM sterol O-asiltransferaz 1 (SOAT1) tarafından kolesterolden sentezlenir. 4
Kolesterol depo formu CE, CE lipoproteinler taşınır ve lipoproteinler dokulara dolaşımı ile taşınmaktadır. 13 Bir hafta ambar önce kuş embriyoların hızlı bir büyüme var. Yaklaşık sarısı kalan lipit içeriğinin% 68, bu aşamada emilir. 10 lipidler bir AET araştırma modeli ile açıklık kazanabilir kullanılmaktadır sarısı hangi mekanizma. Bir tavuk EEC kültürü protokolü bu araştırma hedefe ulaşmak için kurulmuştur. 2, 9 Ancak, gelişmiş AET hücre kültürü prosedürü ile besin kullanımını aracılık belirli enzimler ve proteinlerin fonksiyonlarını incelemek için gerekli doku eksplant düşük başarı oranına gelişimi sırasında kuş embriyolar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki kültürü sistemi, sadece sınırlı bir başarı olduğundan, daha iyi bir kültür sistemi gereklidir. Japon bıldırcın YSM endoderm gibi ex-vivo eksplant daha iyi bir büyüme performansı elde etmek için hücre-hücre kavşakları gevşetmek için kollajenaz gibi proteolitik enzimlerle tedavi gerektirir. Verilerimiz kısmi sindirimi tedavi hücre sayısı 2 gün sonra (Şekil 1) için tohumlama sonra sindirilmemiş doku kültüründen daha fazla olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, kı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mevcut protokolün geliştirilmesi için finansman özellikle Ulusal Tayvan Üniversitesi, Tayvan (hibe ID-104R350144) yanı sıra, Tayvan Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (hibe kimliği "Top Üniversitesi Planı Amaç" tarafından desteklenmektedir: EN 104 -2313-B-002-039-My3). Biz özellikle mevcut çalışma için bir hayvan odası ve laboratuar alanı sağlamak için Ulusal Tayvan Üniversitesi Biyoteknoloji Merkezi teşekkür ederiz.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by Life technologies | 12800-017 10 X 1 L | For wash the EECs pellets |
| D-MEM/F-12 | Gibco by Life technologies | 12400-024 10 X 1 L | As the basal medium in culturing EECs |
| NBCS | Gibco by Life technologies | 16010-159 | As the supplyment serum in culturing EECs |
| Pen-Strep Ampho. Solution | BI (Biological Industries) | 03-033-1B 100ml | For attenuating the possible infection |
| Collagenase Type IV | Gibco by Life technologies | 17104-019 1g | Collagenase is a protease with specificity for the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-XGly-Pro. As the protease for dissociation of cells from primary tissue. |
| 24 well plate | FALCON® | REF-353047 | For EECs to attach and extension |
| 50 ML PP centrifuge tubes | Corning® CentriStarTM | 430829 | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| 50ML Conical bottomed Tube with Cap | PRO TECH | CT-50-PL-TW | For transportion of membranes and enzyme digestion |
| Reciprocal shaking bath | DEAGLE | SB302 | For better enzymatic digestion on membranes |
References
- Abeyrathne, E. D., Lee, H. Y., Ahn, D. U. Egg white proteins and their potential use in food processing or as nutraceutical and pharmaceutical agents–a review. Poult Sci. 92 (12), 3292-3299 (2013).
- Bauer, R., Plieschnig, J. A., Finkes, T., Riegler, B., Hermann, M., Schneider, W. J. The developing chicken yolk sac acquires nutrient transport competence by an orchestrated differentiation process of its endodermal epithelial cells. J Biol Chem. 288 (2), 1088-1098 (2013).
- Ding, S. T., Nestor, K. E., Lilburn, M. S. The concentration of different lipid classes during late embryonic development in a randombred turkey population and a subline selected for increased body weight at sixteen weeks of age. Poult Sci. 74 (2), 374-382 (1995).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The developmental expression of acyl-coenzyme A: cholesterol acyltransferase in the yolk sac membrane, liver, and intestine of developing embryos and posthatch turkeys. Poult Sci. 79 (10), 1460-1464 (2000).
- Ding, S. T., Lilburn, M. S. The ontogeny of fatty acid-binding protein in turkey (Meleagridis gallopavo) intestine and yolk sac membrane during embryonic and early posthatch development. Poult Sci. 81 (7), 1065-1070 (2002).
- Kanai, M., Soji, T., Sugawara, E., Watari, N., Oguchi, H., Matsubara, M., Herbert, D. C. Participation of endodermal epithelial cells on the synthesis of plasma LDL and HDL in the chick yolk sac. Microsc Res Tech. 35 (4), 340-348 (1996).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Structure of the endodermal epithelium of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 155 (3), 287-309 (1979).
- Mobbs, I. G., McMillan, D. B. Transport across endodermal cells of the chick yolk sac during early stages of development. Am J Anat. 160 (3), 285-308 (1981).
- Nakazawa, F., Alev, C., Jakt, L. M., Sheng, G. Yolk sac endoderm is the major source of serum proteins and lipids and is involved in the regulation of vascular integrity in early chick development. Dev Dyn. 240 (8), 2002-2010 (2011).
- Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Prog Lipid Res. 29 (2), 107-140 (1990).
- Shand, J. H., West, D. W., McCartney, R. J., Noble, R. C., Speake, B. K. The esterification of cholesterol in the yolk sac membrane of the chick embryo. Lipids. 28 (7), 621-625 (1993).
- Speier, J. S., Yadgary, L., Uni, Z., Wong, E. A. Gene expression of nutrient transporters and digestive enzymes in the yolk sac membrane and small intestine of the developing embryonic chick. Poult Sci. 91 (8), 1941-1949 (2012).
- Walzem, R. L., Hansen, R. J., Williams, D. L., Hamilton, R. L. Estrogen Induction of VLDLy Assembly in Egg-Laying Hens. J Nutr. 129 (2), 467S-472S (1999).
- Yoshizaki, N., Soga, M., Ito, Y., Mao, K. M., Sultana, F., Yonezawa, S. Two-step consumption of yolk granules during the development of quail embryos. Dev Growth Differ. 46 (3), 229-238 (2004).
- . . alamarBlue Cell Viability Assay Protocol. , (2008).
- Lin, H. Y., Chen, C. C., Chen, Y. J., Lin, Y. Y., Mersmann, H. J., Ding, S. T. Enhanced Amelioration of High-Fat Diet-Induced Fatty Liver by Docosahexaenoic Acid and Lysine Supplementations. Biomed Res Int. 2014 (1), 310981 (2014).
- Lin, Y. Y., et al. Adiponectin receptor 1 regulates bone formation and osteoblast differentiation by GSK-3β/β-Catenin signaling in mice. Bone. 64, 147-154 (2014).
