Ex Vivo оптогенетика Вскрытие страха схем в головном мозге Ломтики
Summary
Оптогенетика подходы широко используются для манипулирования нейронной активности и оценивать последствия для функционирования мозга. Здесь методика изложена , что при экспрессии в естественных условиях оптического активатора Channelrhodopsin, позволяет экс естественных условиях анализа синаптических свойств конкретного дальнего радиуса действия и локальных нейронных связей в цепях страха , связанных с .
Abstract
Оптогенетика подходы в настоящее время широко используется для изучения функции нейронных популяций и схем путем объединения целевых экспрессии легких активированных белков и последующей манипуляции нейронной активности светом. Channelrhodopsins () являются ХР света селекцией катионообменной каналы и когда слитые с флуоресцентным белком их выражение позволяет для визуализации и одновременной активации специфических типов клеток и их аксонов проекции в определенных областях мозга. С помощью стереотаксической инъекции вирусных векторов, CHR слитые белки могут быть конститутивной или условно выражается в специфических клетках определенной области мозга, и их аксонов проекции могут впоследствии быть изучены анатомически и функционально с помощью экс естественных условиях оптогенетика активации в срезах мозга. Это особенно важно, когда с целью понять синаптические свойства соединений, которые не могут быть решены с помощью обычных электрических подходов стимуляции, или при определении нового AFFEаренда и подключение эфферентной, который ранее был мало изучен. Вот, несколько примеров показывают, как этот метод может быть применен для исследования этих вопросов к выяснению цепи страха, связанных в миндалине. Миндалина является ключевым регионом для приобретения и выражения страха и хранения страха и эмоциональных воспоминаний. Многие линии доказательств указывают на то, что медиальная префронтальная кора головного мозга (MPFC) участвует в различных аспектах приобретения страха и исчезновения, но его точное подключение с миндалине только начинает понимать. Во- первых, показано , как экс виво оптогенетика активации может быть использован для изучения аспектов синаптической связи между MPFC афферентов и клеток – мишеней в базолатеральной миндалине (BLA). Кроме того, показано , как это экс виво оптогенетика подход может быть применен для оценки новых моделей подключения , с помощью группы ГАМКергических нейронов в миндалине, то paracapsular интеркалированная кластера клеток (mpITC), в качестве примера.
Introduction
Точные инструменты для визуализации и одновременной активации специфических связей между областями мозга и определенными типами нейронов становятся все более важными для понимания функциональной связности основные функции мозга здоровых и болезненных состояний. В идеале, это влечет за собой физиологическое исследование точных синаптических свойств, с которыми выявлены нейроны общаются. Это особенно верно в отношении связей между областей мозга, которые не могут храниться в одном срезе острого мозга. В прошлом это было в значительной степени достигнуто в отдельных экспериментах. С одной стороны, нейронные трассеры впрыскивается в естественных условиях, были использованы в сочетании с последующим светом или электронно – микроскопического анализа пред- и постсинаптического партнеров. С другой стороны, когда волоконно-трактов из региона происхождения сохраняются и доступны при приготовлении слайсов, электростимуляция использовалась для оценки синаптические механизмы связи с клетками в целевом регионе,
С появлением оптогенетика, целевое выражение легких селекцией катион-каналы, такие как Channelrhodopsins (ХР) , слитого с флуоресцентными белками, теперь позволяет активацию нейронов и их аксонов траекторий позволяя при этом для их визуализации и ретроспективном анатомического анализа 1- 4. Поскольку CHR-экспрессирующие аксоны могут стимулироваться даже когда отделено от родительского somata 5, можно в мозговых срезах: 1) оценить исходные данные из областей мозга , которые не были доступны с обычной электрической стимуляции, так как волокна тракты не являются разделяемыми или конкретная траектория не известно; 2) однозначно определить область происхождения для конкретных входов, которые были постулируется, но не вполне понятных; и 3) исследовать функциональную связь между определенными типами клеток, как локально, так и в долгосрочных прогнозов. Из-за ряда преимуществ, это оптогенетика отображение схем в срезах мозга становится широкимLY используется в последние годы, и различные вирусные векторы для экспрессии флуоресцентно-меченый ХР легко доступны от коммерческих поставщиков. Некоторые ключевые преимущества оптогенетика активации по сравнению с обычными электрической стимуляции не являются повреждения ткани вследствие размещения стимуляции электродов, специфичность стимуляции волокон, потому что электрическая стимуляция может также набрать волокон прохода или других соседних ячеек, и столь же быстрым и во времени точной стимуляции. Кроме того, стереотаксической инъекции вирусных векторов легко могут быть направлены на конкретные области мозга 6 и условной или камерного типа конкретное выражение может быть достигнуто с помощью Cre-зависимую экспрессию и / или специфические промоторы 7. Здесь этот метод применяется для отображения дальнего радиуса действия и локальных схем в системе страха.
Миндалина является ключевым регионом для приобретения и выражения страха и хранения страха и эмоциональных воспоминаний 8,9. Помимо сюдам миндалины, медиальная префронтальная кора головного мозга (MPFC) и гиппокамп (HC), структуры, которые взаимно соединены с миндалине, участвуют в аспектах приобретения, консолидации и поиска страха и исчезновения воспоминаний 10,11. Деятельность в подразделениях MPFC – видимому, играет двойную роль в регулировании как высокого и низкого страха заявляет 12,13. Это может быть частично опосредовано прямыми связями с MPFC к миндалине, которая будет контролировать активность миндалины и выход. Таким образом, в последние годы, некоторые исследования начались в естественных условиях экспериментов бывших срезов для исследования синаптических взаимодействий между MPFC афферентов и специфических клеток – мишеней в миндалине 14-17.
Во время обучения страха, сенсорная информация об условных и безусловных раздражителей достигает миндалины с помощью проекций из специфических таламических и корковых областей. Пластичность этих входов нейронов в боковой части (LA) от basolateral миндалине (БЛА) является важным механизмом , лежащим страх кондиционирования 9,18. Увеличение данные свидетельствуют о том, что параллельные пластические процессы в миндалине включают ингибирующие элементы для управления памятью страха 19. Группа кластерной тормозных нейронов являются ГАМКергических медиальной paracapsular интеркалированного клетки (mpITCs), но их точная связь и функция не вполне понятно , 20-22. Здесь отображение оптогенетика схема используется для оценки афферентные и эфферентные соединения этих клеток и их воздействие на целевые нейроны в мозжечковой миндалине, демонстрируя , что mpITCs получают прямой сенсорный вход от таламуса и коркового ретрансляционных станций 23. Конкретное выражение ПГО в mpITCs или Bla нейронов позволяет отображение локальных взаимодействий, показывая, что mpITCs подавляют, но и взаимно активируются, Bla главных нейронов, помещая их в новые прямой подачи и обратной ингибирующих цепей, которые эффективно контролируют активность BLA23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод экс естественных условиях оптогенетика исследования нейронных цепей и локальной связи , которые могут быть легко реализованы на большинстве, если не все, в вертикальном положении ломтика записи патч-зажим расстановок, оснастив их с ~ 470 нм LED на эпифлу…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Materials
| Surgery | |||
| Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
| Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
| Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
| Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
| Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
| Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
| DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
| Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
| Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
| rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
| rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
| rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
| fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
| Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
| Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
| Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
| Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
| Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
| Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
| Recordings, light stimulation, and analysis | |||
| artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
| internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
| MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
| Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
| Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
| Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
| Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
| Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
| Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
| Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
| Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
| PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
| Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
| Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
| Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
| glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
| Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
| LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
| CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
| LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
| Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
| Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
| (emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
| Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
| (beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
| (emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
| LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
| IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
| Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
| Post hoc analysis of injections and projections | |||
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
| Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
| agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
| 30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
| Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
| cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
| Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
| cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
| Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany | ||
References
- Nagel, G. et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945, (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., & Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268, (2005).
- Tye, K. M., & Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13 (4), 251-266, (2012).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., & Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34, (2011).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., & Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668, (2007).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., & Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173, (2006).
- Huang, Z. J., & Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215, (2013).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184, (2000).
- Pape, H. C., & Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90 (2), 419-463, (2010).
- Myers, K. M., & Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12 (2), 120-150, (2007).
- Quirk, G. J., & Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33 (1), 56-72, (2008).
- Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., & Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733, (2006).
- Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., & Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36 (2), 529-538, (2011).
- Cho, J. H., Deisseroth, K., & Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80 (6), 1491-1507, (2013).
- Arruda-Carvalho, M., & Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34 (47), 15601-15609, (2014).
- Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., & Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64, (2014).
- Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., & Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10 (9), 1435-1442, (2015).
- Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., & LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory. Neuropharmacology. 52 (1), 215-227, (2007).
- Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., & Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62 (6), 757-771, (2009).
- Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247 (2), 246-271, (1986).
- Busti, D. et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31 (13), 5131-5144, (2011).
- Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., & Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234, (2012).
- Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., & Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86 (2), 541-554, (2015).
- Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., & Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467 (1), 60-79, (2003).
- Mar, L., Yang, F. C., & Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, 3, (2012).
- Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., & Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34 (22), 7704-7714, (2014).
- Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., & Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16 (3), 332-339, (2013).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., & Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145, (2009).
- Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., & Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79 (4), 658-664, (2013).
- Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., & Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32 (42), 14815-14820, (2012).
- Zhang, Y. P., & Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4 (2), 139-141, (2007).
- Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., & Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76 (4), 790-803, (2012).
- Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., & Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415, (2011).
- Morozov, A., Sukato, D., & Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31 (1), 339-345, (2011).
- Davidson, B. L., & Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4 (5), 353-364, (2003).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., & Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310, (2013).
- Salegio, E. A. et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20 (3), 348-352, (2013).
- Holehonnur, R. et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, 28, (2014).
- McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., & McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109 (3), 838-845, (2009).
- Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., & Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, 8, (2013).
