Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
microscopia em grande escala de elétrons 2D (EM), ou nanotomy, é a aplicação de todo o tecido da microscopia eletrônica de resolução nanoescala. Outros e que anteriormente aplicada EM larga escala para ilhotas pancreáticas humanas da pele, cultura de tecidos e toda larvas do peixe 1-7. Aqui nós descrevemos um método universalmente aplicável para EM digitalização escala tecido para detecção imparcial de recursos sub-celulares e moleculares. Nanotomy foi aplicado para investigar o saudável e um cérebro de peixe zebra neurodegenerativa. Nosso método é baseado em protocolos de preparação de amostra padronizados EM: fixação com glutaraldeído e ósmio, seguido por incorporação de resina de epóxi, ultrafinos de corte e montagem de ultrafinos-seções sobre grades de um furo, seguido de pós coloração com uranyl e chumbo. Em larga escala de imagens 2D em mosaico são adquiridos usando uma varredura EM conectada a um gerador de varredura ampla área externa usando EM transmissão de varredura (STEM). Grande escala imagens EM são tipicamente ~ 5 – 50 g de pixels itamanho n, e melhor visualizado usando arquivos HTML com zoom, que pode ser aberto em qualquer navegador web, semelhante a mapas HTML geográficas on-line. Este método pode ser aplicado ao tecido (ser humano), as secções transversais de animais inteiros, bem como cultura de tecidos 1-5. Aqui, os cérebros de peixe-zebra foram analisados em um modelo de ablação neuronal não-invasiva. Visualiza-se dentro de um único conjunto de dados de tecidos, celular e alterações subcelulares que pode ser quantificada em vários tipos de células incluindo neurónios, macrófagos e microglia do cérebro. Além disso, nanotomy facilita a correlação de EM com microscopia de luz (CLEM) 8 no mesmo tecido, como grandes áreas de superfície trabalhada anteriormente usando microscopia de fluorescência, pode ser subsequentemente submetida a grande área de EM, resultando na nano-anatomia (nanotomy) de tecidos. Ao todo, nanotomy permite a detecção imparcial de recursos a nível EM de forma quantificável todo o tecido.
desenvolvimentos técnicos recentes têm melhorado a versatilidade, aplicabilidade e natureza quantitativa da EM, levando a um renascimento da análise ultra-estrutural. Os avanços incluem 3D EM, em larga escala 2D EM e métodos aperfeiçoados e reagentes para microscopia de luz e microscopia eletrônica correlata (CLEM) para comparar outros modos de análise microscópica diretamente para o nível EM 8-10. Em larga escala de 2D EM é particularmente adequado para quantificar ou identificar (romance) características da doença de patologia humana, estudo de modelos animais para modelos de doença e de cultura de tecidos. Devido à pequena tipicamente campo de visão que é difícil de correlacionar as modificações em alta ampliação com uma escala larga de tecido, bem como para analisar quantitativamente unbiasedly e características ultra-estruturais.
Para a análise patológica de tecido humano ou a avaliação da patologia em modelos animais, hematoxilina e eosina (H & E) colorido seções de formaldeído parafina fixo incorporado (FFPE) tissue é o padrão. Além de simples H & E coloração imunomarcação também é realizada para identificar anomalias patológicas. Se tais tecidos pode ser analisada ao nível EM, tipos específicos de células, e as alterações intracelulares podem ser identificados. A natureza imparcial de EM em grande escala permite encontrar características inesperadas e novos da doença. Por larga escala áreas em up a milímetros quadrados pode ser visualizado. Nós e outros anteriormente nanotomy de rato ilhotas pancreáticas 4, cultura de células 2, cérebro do rato 3, pele e mucosa 7 e toda larvas do peixe 1,5 (www.nanotomy.org) aplicada. Os peixes-zebra são altamente adequados para imagiologia in vivo, em particular para visualizar os tipos de células que são de difícil acesso, em tecidos de mamíferos, incluindo as células cerebrais imunológicas 11. Aqui o procedimento nanotomy é descrito em pormenor, aplicadas a secções coronais de cabeças de peixe-zebra submetidos à ablação condicional neuronal por conversão de metronidazol por neuronalnitro-redutase expressa (www.nanotomy.org) 5,12-14. Todos os dados brutos são apresentados como arquivos HTML com zoom, visualização molecular para mudanças de escala do tecido. A apresentação dos dados brutos permite análises imparciais sobre os conjuntos de dados de outros ângulos de especialistas em todo o mundo.
EM permite a análise de contexto celular com imagens de alta resolução das macromoléculas em contexto biológico. No entanto, isso normalmente limita o campo de visão. Maior escala 3D EM é particularmente adequado para a conectividade mapeamento neuronal através da criação de resolução nanoescala 3 reconstruções tridimensionais, exigindo processamento de dados complexos 10. Em contraste, 2D larga escala EM requer apenas uma única seção e costura dos dados de imagem e avaliação dos dados é possível por qualquer pessoa com acesso a um navegador de Internet. Nós e outros anteriormente utilizado EM grande escala para analisar tecidos e animais inteiros. Quanto mais se aproxima, TEM e costura à base de SEM tem suas próprias vantagens. Aqui, a transmissão de varredura EM (STEM) foi usada que permite a geração de um grande campo de visão em alta resolução. Normalmente, uma imagem STEM é equivalente aos campos de visão de cerca de 100 imagens de TEM, reduzindo significativamente a quantidade de costura quando imagiologia grande fields de vista em alta resolução. Se mais de alta resolução é necessária, pode ser vantajoso MET. HASTE tem a vantagem sobre TEM que as amostras não contrastou pode ser utilizado com um bom contraste ultra-6.
Além disso, o método descrito aqui pode ser simplesmente ajustadas para utilização com uma detecção electrónica dispersa de volta (DEB) em secções montadas em lâminas de Si, o alargamento do uso de vários sistemas de microscópio. Tecidos HTML-zoomable arquivos EM são muito útil para a quantificação, a partilha de dados que podem não ter sido analisados ao seu conteúdo completo, combinando LM e os dados de EM (Clem) 8, fins de apresentação na investigação científica, para analisar os dados do paciente, e para a educação. Alternativamente, em EM grande escala num SEM, mas não de uma ETM, bolachas de sílica pode ser usado, o qual tem duas vantagens principais: BSD pode ser utilizado, o que é mais, geralmente disponíveis no microscópios electrónicos de varrimento de detecção STEM. Em segundo lugar, a montagem de grandes secções (> 1 mm 2 áreas dejuros) é simples. Montagem sobre grelhas de fenda simples é trabalhoso e tecnicamente desafiador. Comparação detalhada entre TEM, SEM e STEM é detalhado em outros lugares 6. Uma desvantagem de imagiologia BSD é que, em comparação com caule, as imagens têm um aumento de ruído. Isto pode em parte ser compensada pelo aumento do tempo de permanência do pixel, resultando em tempos de aquisição mais longos.
Embora para preparação de amostras de processamento relativamente padrão EM (fixação, incorporação e de corte) é necessária 5-7, é tecnicamente desafiador para cortar grandes cortes ultrafinos completamente desprovido de artefatos. As seções são muito frágeis, facilmente quebrar, dobrar ou são destruídas durante o exame, o que normalmente leva várias horas por conjunto de dados. No entanto, devido à partilha on-line dos dados brutos imparciais, deve tornar-se possível comparar mais facilmente com dados publicados, e usar conjunto de dados publicados no domínio aberto como controlos. Actualmente, alguns dispositivos EM capaz de Laanálise rge escala estão em uso e, portanto, a acessibilidade a esta técnica é um pouco limitada, embora a maioria dos centros de imagem acolher os esforços de colaboração.
Para as secções de grande escala o tecido tem de ser correctamente fixada em toda a amostra. É por isso uma mistura do jejum, mas moderada fixador PFA é utilizado em combinação com a lenta mas forte fixador GA. Corte e pegar grandes seções sem artefatos é difícil. Trabalhando com wafers em combinação com BSD é mais fácil em comparação com a coleta seções em grades único furo. Heavy metal post coloração é mais crítica em relação a EM clássica. Desde a seção inteira é imaginada cada artefato será visível. usuários TEM normalmente têm dificuldade em mudar para um SEM, por causa da diferença na operação microscópio.
Quantificação e partilha de dados – Quantificar características subcelulares é difícil em imagens EM individuais. A possibilidade de zoom in e out de grande escalaimagens permite prontamente a identificação das células de interesse, que pode ser seguido por meio de medições em nano-escala no interior das células. Estes conjuntos de dados indicam que tipos específicos de células podem ser rapidamente identificados e quantificados de forma imparcial nestas secções de tecido de grande porte, com base em características detectáveis em diferentes escalas. Por exemplo microglia podem ser identificados com base na sua morfologia e citoplasma denso. Posteriormente, após zoom em células individuais, características subcelulares e moleculares em nanoescala dessas células pode ser medida dentro do mesmo conjunto de dados, como mostramos anteriormente para a largura ER dentro de uma larga escala de tecido EM cultura conjunto de dados 2. Uma vantagem adicional é que nanotomy hospedagem de conjuntos de dados de grande escala on-line irá permitir que outros para inspecionar os dados, talvez para outros recursos, e tirar suas conclusões sobre a nova hipótese.
CLEM – Além de facilitar EM quantitativo, EM grande escala torna mais fácil correlacionar microsco luzrotulagem pic EM nível 8. No presente exemplo, mostra-se a presença da microglia fagocíticas num modelo de ablação do peixe-zebra. Uma questão importante em neurociência é o que as funções e as contribuições individuais são de microglia e potenciais outras fontes de fagocíticas e células do sistema imunológico. Estudos EM preliminares mostraram características subcelulares distintas de microglia na doença 18. Infelizmente, é difícil rotular selectivamente microglia em particular numa configuração patológica, uma vez que exibem grande sobreposição com outras células do sistema imunológico na expressão genética, a morfologia e função. Portanto, não é claro se a microglia e quando ao nível ultra-estrutural diferente a partir de células imunes de outras fontes, incluindo derivados de monócitos macrófagos infiltrantes. Entender se existem diferenças ultra-estruturais entre estas células irá proporcionar um ponto de partida para a análise das diferenças funcionais. Combinando marcadores transgênicos ou expressão selectiva e CLEM permite que detexão de características ultra-estruturais seletiva para populações específicas.
Diagnóstico & apresentação e educação – Ao visualizar nanoescala a microescala dentro de um único conjunto de dados de dados EM é muito facilitada a um público amplo. Com o aumento das possibilidades e ferramentas para a EM-larga escala correlativa e prevemos um renascimento do EM em pesquisa básica e médica. O nosso método aqui representado é aplicado a um modelo de lesão de cérebro de peixe zebra 5, mas foi usado no tecido humano 7, cérebro de rato 3, num modelo de rato de diabetes 4 e em cultura de células de 2, e também pode ser utilizado em combinação com uma ETM abordagem com base na 1 que mostra a versatilidade deste método. O operador microscópio não é mais a gravação altamente selecionada e imagens, portanto, tendenciosas, mas todos os inúmeros recursos ultra-estruturais são registrados e aberto para análise em todo o mundo.
The authors have nothing to disclose.
Maior parte do trabalho foi realizada no UMCG Microscopia e Imaging Center (UMIC), que é patrocinado pela NWO 175-010-2009-023 e ZonMW 91.111.006; STW "Microscopia Vale 12718" para BNGG. Este trabalho foi patrocinado por uma concessão ZonMW Veni, uma bolsa de integração na carreira Marie Curie (economia morrendo neurônios) e uma bolsa de Alzheimer Nederland para TJvH
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |