Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
बड़े पैमाने पर 2 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), या nanotomy, nanoscale संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के ऊतक चौड़ा आवेदन पत्र है। दूसरों के लिए और हम पहले से मानव त्वचा अग्नाशय टापू, टिशू कल्चर और पूरे zebrafish लार्वा 1-7 करने के लिए बड़े पैमाने पर ईएम लागू होता है। यहाँ हम उप सेलुलर और आणविक सुविधाओं की निष्पक्ष जांच के लिए ऊतक पैमाने पर स्कैनिंग ईएम के लिए एक सार्वभौमिक रूप से लागू विधि का वर्णन है। Nanotomy स्वस्थ और एक neurodegenerative zebrafish मस्तिष्क की जांच करने के लिए लागू किया गया था। हमारे विधि मानकीकृत ईएम नमूना तैयार प्रोटोकॉल पर आधारित है: फिक्सेशन glutaraldehyde और आज़मियम साथ, epoxy राल embedding द्वारा पीछा किया सेक्शनिंग और एक छेद ग्रिड पर ultrathin वर्गों, uranyl और नेतृत्व के साथ पोस्ट धुंधला द्वारा पीछा के बढ़ते ultrathin। बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम पच्चीकारी छवियों को एक स्कैनिंग ईएम स्कैनिंग संचरण ईएम (स्टेम) का उपयोग कर एक बाहरी बड़े क्षेत्र स्कैन जनरेटर से जुड़ा का उपयोग कर हासिल किया है। 50 जी पिक्सल मैं – बड़े पैमाने ईएम छवियों आमतौर पर ~ 5 हैंn आकार, और सबसे अच्छा zoomable एचटीएमएल फ़ाइलें, जो किसी भी वेब ब्राउज़र में खोला जा सकता है, ऑनलाइन भौगोलिक HTML नक्शे के लिए इसी तरह का उपयोग करके देखा। इस विधि (मानव) ऊतक, पूरे जानवरों के पार वर्गों के साथ-साथ टिशू कल्चर 1-5 के लिए लागू किया जा सकता है। इधर, zebrafish दिमाग एक गैर इनवेसिव न्यूरोनल पृथक मॉडल में विश्लेषण किया गया। हम एक ही डाटासेट ऊतक, सेलुलर और subcellular परिवर्तन जो न्यूरॉन्स और microglia, मस्तिष्क की मैक्रोफेज सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है के भीतर कल्पना। इसके अलावा, nanotomy, एक ही ऊतक पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी (क्लेम) के साथ ईएम के सहसंबंध 8 की सुविधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में बड़े सतह क्षेत्रों में पहले से imaged, बाद में की नैनो शरीर रचना विज्ञान (nanotomy) में जिसके परिणामस्वरूप, बड़े क्षेत्र ईएम के अधीन किया जा सकता है ऊतकों। सभी में, nanotomy एक ऊतक विस्तृत मात्रात्मक तरीके से ईएम स्तर पर सुविधाओं की निष्पक्ष पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
हाल ही में तकनीकी विकास बहुमुखी प्रतिभा, प्रयोज्यता और ईएम के मात्रात्मक प्रकृति में सुधार हुआ है, Ultrastructural विश्लेषण की एक पुनरुद्धार के लिए अग्रणी। अग्रिम सीधे ईएम स्तर 8-10 के लिए सूक्ष्म विश्लेषण के अन्य साधनों की तुलना करने के लिए 3 डी ईएम, बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम और बेहतर तरीके और सहसंबद्ध प्रकाश माइक्रोस्कोपी और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्लेम) के लिए अभिकर्मकों शामिल हैं। बड़े पैमाने पर 2 डी ईएम विशेष रूप से यों या (उपन्यास) मानव विकृति के लिए रोग सुविधाओं की पहचान, बीमारी और टिशू कल्चर मॉडल के लिए पशु मॉडल का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। देखने के लिए आम तौर पर छोटे से क्षेत्र के कारण यह एक ऊतक व्यापक पैमाने पर करने के लिए उच्च वृद्धि पर परिवर्तन सहसंबंधी, साथ ही unbiasedly और मात्रात्मक ultrastructural सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है।
मानव ऊतक या पशु मॉडल में विकृति का मूल्यांकन, haematoxylin और eosin (एच एंड ई) रंग formaldehyde तय एम्बेडेड आयल के वर्गों (FFPE) आज़ादी के रोग विश्लेषण के लिएमुकदमा मानक है। सरल इसके अलावा एच एंड ई धुंधला immunolabeling भी रोग असामान्यताएं की पहचान के लिए किया जाता है। इस तरह के ऊतकों ईएम स्तर, विशेष प्रकार की कोशिकाओं में विश्लेषण किया जा सकता है, और subcellular परिवर्तनों की पहचान की जा सकती है। बड़े पैमाने पर ईएम की निष्पक्ष प्रकृति रोग की अप्रत्याशित और उपन्यास सुविधाओं को खोजने के लिए अनुमति देता है। बड़े पैमाने पर रखकर वर्ग मिलीमीटर ईएम क्षेत्रों को देखे जा सकते हैं। हम और दूसरों को पहले से अग्नाशय टापू 4 चूहे के लिए nanotomy, सेल संस्कृति 2, 3 चूहे के मस्तिष्क, त्वचा और म्यूकोसा 7 और पूरे zebrafish लार्वा 1,5 (www.nanotomy.org) लागू होता है। Zebrafish में vivo इमेजिंग के लिए अत्यधिक उपयुक्त है, विशेष रूप में सेल प्रकार जो मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं 11 सहित स्तनधारी ऊतकों में उपयोग करने के लिए मुश्किल हो जाता है कल्पना करने के लिए कर रहे हैं। यहाँ nanotomy प्रक्रिया में विस्तार से वर्णन किया गया है, न्यूरोनल द्वारा metronidazole के रूपांतरण द्वारा सशर्त न्यूरोनल पृथक दौर से गुजर zebrafish सिर के राज्याभिषेक वर्गों के लिए लागूव्यक्त nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14। सभी कच्चे डेटा zoomable HTML फ़ाइलों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, ऊतक पैमाने पर परिवर्तन करने के लिए आणविक visualizing। कच्चे डेटा की प्रस्तुति के लिए दुनिया भर के विशेषज्ञों द्वारा अन्य कोणों से डेटासेट का निष्पक्ष विश्लेषण की अनुमति देता है।
ईएम जैविक संदर्भ में अणुओं के उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ सेलुलर संदर्भ के विश्लेषण की अनुमति देता है। बहरहाल, यह आमतौर पर देखने के क्षेत्र को सीमित करता है। बड़े पैमाने पर 3 डी ईएम विशेष रूप से nanoscale संकल्प 3 आयामी पुनर्निर्माण बनाने, जटिल डाटा प्रोसेसिंग 10 की आवश्यकता द्वारा मानचित्रण न्यूरोनल कनेक्टिविटी के लिए उपयुक्त है। इसके विपरीत, 2 डी बड़े पैमाने पर ईएम केवल एक ही अनुभाग और इमेजिंग डेटा की सिलाई की आवश्यकता है, और डेटा के आकलन के एक इंटरनेट ब्राउज़र के उपयोग के साथ किसी के द्वारा संभव है। हम और दूसरों को पहले से बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया ईएम ऊतकों और पूरे जानवरों का विश्लेषण करने के लिए। सबसे दृष्टिकोण, मंदिर और SEM आधारित सिलाई के लिए के रूप में अपने फायदे हैं। इधर, स्कैनिंग संचरण ईएम (स्टेम) का इस्तेमाल किया गया था कि उच्च संकल्प पर देखने के एक बड़े क्षेत्र की पीढ़ी की अनुमति देता है। आमतौर पर, एक स्टेम छवि लगभग 100 मंदिर छवियों, काफी सिलाई की मात्रा को कम करने की दृष्टि से खेतों के बराबर बड़े महसूस जब इमेजिंग हैउच्च संकल्प पर देखने के डी एस। उच्च संकल्प की जरूरत है, मंदिर फायदेमंद हो सकता है। स्टेम मंदिर से अधिक लाभ है कि गैर-विषम नमूने अच्छा ultrastructural विपरीत 6 के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है।
इसके अतिरिक्त, विधि यहाँ वर्णित बस वापस बिखरे हुए इलेक्ट्रॉन का पता लगाने (बीएसडी) पर वर्गों सिलिका वेफर्स पर मुहिम शुरू की है, कई माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए उपयोग का विस्तार करने के साथ उपयोग के लिए समायोजित किया जा सकता है। एचटीएमएल zoomable ऊतक ईएम फ़ाइलों डेटा कि अपनी पूरी सामग्री के लिए विश्लेषण नहीं हो सकता है किया गया है, वैज्ञानिक अनुसंधान के क्षेत्र में एल एम और ईएम डेटा (क्लेम) 8, प्रस्तुति प्रयोजनों के संयोजन साझा करने, रोगी डेटा का विश्लेषण करने के लिए, और शिक्षा के लिए, मात्रा का ठहराव के लिए बहुत उपयोगी होते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक SEM में बड़े पैमाने पर ईएम में है, लेकिन एक मंदिर में नहीं, सिलिका वेफर्स इस्तेमाल किया जा सकता है, जो दो मुख्य फायदे हैं: बीएसडी इस्तेमाल किया जा सकता है, जो आम तौर पर और अधिक का पता लगाने के स्टेम से स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप पर उपलब्ध है। दूसरा, बड़े वर्गों (> 1 मिमी 2 क्षेत्रों के बढ़तेब्याज) सीधा है। एकल slotted ग्रिड पर बढ़ते श्रम गहन और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। मंदिर, SEM और स्टेम के बीच विस्तृत तुलना कहीं और 6 विस्तृत है। बीएसडी इमेजिंग का एक नुकसान यह है कि, स्टेम की तुलना में, छवियों शोर बढ़ गई है। यह आंशिक रूप से पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय बढ़ रही है, बहुत लंबे समय तक अधिग्रहण के समय में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा मुआवजा दिया जा सकता है।
हालांकि नमूना तैयार अपेक्षाकृत मानक ईएम प्रोसेसिंग (निर्धारण, एम्बेडिंग और सेक्शनिंग) के लिए 5-7 की जरूरत है, यह कलाकृतियों का पूरी तरह से रहित बड़े ultrathin वर्गों में कटौती करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। वर्गों बहुत कमजोर हैं, आसानी से तोड़, गुना या इमेजिंग, जो आम तौर डाटासेट प्रति एकाधिक घंटे लगते दौरान नष्ट कर रहे हैं। हालांकि, कच्चे निष्पक्ष डेटा की ऑनलाइन साझा करने की वजह से, यह संभव प्रकाशित आंकड़ों के और अधिक आसानी से की तुलना, और नियंत्रण के रूप में खुला डोमेन में प्रकाशित डाटासेट का उपयोग करने के लिए होना चाहिए। वर्तमान में, ला में सक्षम कुछ ईएम उपकरणोंrge पैमाने पर विश्लेषण का उपयोग कर रहे हैं, और इसलिए इस तकनीक को आकर्षित कुछ हद तक सीमित है, हालांकि ज्यादातर इमेजिंग केन्द्रों सहयोगात्मक प्रयासों का स्वागत करते हैं।
बड़े पैमाने पर वर्गों के लिए ऊतक ठीक से नमूना भर में तय किया जाना है। यही कारण है कि तेजी से लेकिन मध्यम लगानेवाला पीएफए का एक मिश्रण धीमी लेकिन मजबूत लगानेवाला जीए के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाता है। काटना और कलाकृतियों के बिना बड़े वर्गों उठा मुश्किल है। बीएसडी के साथ संयोजन में वेफर्स के साथ काम करना एक छेद ग्रिड पर वर्गों इकट्ठा करने के लिए की तुलना में आसान है। भारी धातु पद धुंधला शास्त्रीय ईएम की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण है। चूंकि पूरे खंड imaged है हर विरूपण साक्ष्य दिखाई जाएगी। मंदिर उपयोगकर्ताओं को आम तौर यह मुश्किल माइक्रोस्कोप ऑपरेशन में अंतर की वजह से, एक SEM के लिए स्विच करने लगता है।
मात्रा का ठहराव और डेटा साझा – subcellular सुविधाओं बढ़ाता ही ईएम छवियों में मुश्किल है। संभावना में और बड़े पैमाने के बाहर ज़ूम करने के लिएछवियों को आसानी से ब्याज की कोशिकाओं है, जो कोशिकाओं के अंदर nanoscale माप के द्वारा पीछा किया जा सकता है की पहचान के लिए अनुमति देता है। ये डेटासेट संकेत मिलता है कि विशेष प्रकार की कोशिकाओं में तेजी से पहचाना जा सकता है और इन बड़े ऊतक वर्गों में एक निष्पक्ष ढंग से मात्रा निर्धारित है, अलग अलग पैमानों पर पहचाने जाने विशेषताओं के आधार पर। उदाहरण के लिए microglia उनकी आकृति विज्ञान और घने कोशिका द्रव्य के आधार पर पहचाना जा सकता है। बाद में, व्यक्ति की कोशिकाओं पर zooming पर, इन कोशिकाओं के nanoscale subcellular और आणविक सुविधाओं ही डाटासेट के भीतर, मापा जा सकता है जैसा कि हम पहले एक बड़े पैमाने पर ईएम टिशू कल्चर डाटासेट 2 के भीतर ईआर चौड़ाई के लिए दिखाया। nanotomy का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि बड़े पैमाने पर ऑनलाइन डेटासेट की मेजबानी कर दूसरों डेटा, शायद अन्य सुविधाओं के लिए निरीक्षण करने की अनुमति देगा, और नई परिकल्पना पर अपने निष्कर्ष निकालना है।
भूखों मरना – मात्रात्मक ईएम की सुविधा के अलावा, बड़े पैमाने पर उन्हें यह आसान प्रकाश microsco सहसंबंधी बनाता हैईएम स्तर से 8 पिक लेबलिंग। वर्तमान उदाहरण में एक zebrafish पृथक मॉडल में phagocytic microglia की उपस्थिति दिखाया गया है। तंत्रिका विज्ञान में एक बड़ा सवाल क्या व्यक्तिगत कार्यों और योगदान microglia और phagocytic और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के संभावित अन्य स्रोतों से हो रहा है। प्रारंभिक ईएम पढ़ाई के रोग 18 में microglia की विशिष्ट subcellular सुविधाओं से पता चला है। दुर्भाग्य से, यह चुनिंदा एक रोग की स्थापना में विशेष रूप से microglia लेबल करने के लिए मुश्किल है, के रूप में वे जीन अभिव्यक्ति, आकृति विज्ञान और समारोह में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बड़े ओवरलैप दिखा रहे हैं। इसलिए, यह स्पष्ट नहीं है कि कब और ultrastructural स्तर पर microglia मैक्रोफेज घुसपैठ निकाली गई एककेंद्रकश्वेतकोशिका सहित अन्य स्रोतों से प्रतिरक्षा कोशिकाओं से भिन्न होते हैं। समझ इन कोशिकाओं के बीच मतभेद ultrastructural कार्यात्मक मतभेदों के विश्लेषण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करेगा कर रहे हैं। चयनात्मक ट्रांसजेनिक या अभिव्यक्ति मार्कर का मेल और भूखों मरना Det की अनुमति देता हैultrastructural सुविधाओं के ection विशिष्ट आबादी के लिए चयनात्मक।
निदान और प्रस्तुति और शिक्षा – nanoscale visualizing के लिए एक एकल डाटासेट ईएम डेटा के भीतर microscale करके बहुत एक व्यापक दर्शकों के लिए मदद की है। correlative और बड़े पैमाने पर ईएम के लिए वृद्धि की संभावनाओं और उपकरणों के साथ हम बुनियादी और चिकित्सा अनुसंधान में ईएम की एक पुनरुद्धार की आशा। हमारे विधि यहाँ का प्रतिनिधित्व एक zebrafish मस्तिष्क की चोट 5 मॉडल को लागू किया जाता है, लेकिन मधुमेह 4 के लिए और सेल संस्कृति 2 में मानव ऊतक 7, चूहे के मस्तिष्क 3 पर इस्तेमाल किया गया है, एक चूहे मॉडल में, और यह भी एक मंदिर के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता आधारित दृष्टिकोण 1 इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा दिखा। माइक्रोस्कोप ऑपरेटर नहीं रह अत्यधिक चयन किया जाता है रिकॉर्डिंग, और इसलिए पक्षपातपूर्ण छवियों, लेकिन सभी कई ultrastructural सुविधाओं दर्ज की गई है और दुनिया भर में विश्लेषण के लिए खुले हैं।
The authors have nothing to disclose.
काम के बहुमत UMCG माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सेंटर (UMIC), जो NWO 175-010-2009-023 और ZonMW 91111006 द्वारा प्रायोजित है पर प्रदर्शन किया गया है; STW "माइक्रोस्कोपी घाटी 12718" BNGG करने के लिए। यह काम एक ZonMW VENI अनुदान, मैरी क्यूरी कैरियर एकीकरण अनुदान (न्यूरॉन्स मर बचत) और TJvH करने के लिए एक अल्जाइमर नीदरलैंड फैलोशिप द्वारा प्रायोजित किया गया था
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |