Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
대형 2 차원 전자 현미경 (EM) 또는 nanotomy 나노 스케일 해상도 전자 현미경의 조직 전반의 애플리케이션이다. 기타 우리는 이전에 인간의 피부 췌장 섬, 조직 배양 및 전체 제브라 피쉬 애벌레 1-7로 대규모 EM을 적용했다. 여기에서 우리는 서브 세포 및 분자 기능의 편견 검출을위한 조직 규모 주사 EM에 대해 보편적으로 적용 할 수있는 방법을 설명합니다. Nanotomy는 건강하고 신경 퇴행성 제브라 피쉬의 뇌를 조사하기 위해 적용되었다. 우리의 방법은 표준화 된 EM 샘플 준비 프로토콜을 기반으로합니다 : 고정 글루 타르 알데히드와 오스뮴와, 에폭시 수지 삽입 한 다음 절편과 우라 닐 리드 포스트 염색 한 다음 하나의 홀 그리드에 얇은 섹션, 장착 초박형. 대규모 2D EM 모자이크 이미지 EM 스캔 전송 EM (STEM)를 이용하여 외부의 큰 영역 스캔 발생기에 접속 된 주사를 이용하여 취득한다. 50 G 화소 난 – 대규모 EM 이미지는 일반적으로 5 ~이다n 개의 크기, 최고의 온라인 지리적 HTML지도와 유사한 웹 브라우저에서 열 수있는 줌 가능 HTML 파일을 사용하여 볼. 이 방법은 (인간)의 조직, 간 전체 동물의 부분뿐만 아니라, 조직 배양 1-5에 적용될 수있다. 여기서, 피쉬 뇌 비 침습적 신경 절제 모델에서 분석 하였다. 우리는 신경 세포와 미세 아교 세포, 뇌의 대식 세포 등 다양한 세포 유형으로 정량화 할 수있는 세포 하나의 데이터 집합 조직 및 세포 내 변화에서 시각화. 큰 표면 영역은 이전에 이미징으로 또한 nanotomy 형광 현미경을 사용하여 동일한 조직의 광학 현미경 (클레멘 타인)와 EM의 상관 8 용이이어서 나노 해부학 (nanotomy)의 결과, 대 면적 EM을 실시 할 수있다 조직. 모두에서는, nanotomy는 조직 전체의 정량화 방식으로 EM 수준에서 기능의 편견 검출 할 수있다.
최근의 기술 개발은 미세 구조 분석의 부흥을 선도, EM의 다양성, 적용 및 양적 특성을 개선했다. 진보는 직접 EM 레벨 8-10에 현미경 분석의 다른 모드를 비교하는 3D EM, 대규모 2D EM과 상관 광학 현미경과 전자 현미경 (클레멘 타인)에 대한 개선 된 방법 및 시약을 포함한다. 대규모 2D EM은 계량 또는 인간의 병리에 대한 (소설) 질병 기능을 식별, 질병 및 조직 배양 모델 동물 모델을 연구하기에 적합하다. 때문에보기의 통상적 작은 필드는 조직 대규모로 높은 배율 변화의 상관 관계뿐만 아니라 unbiasedly 정량적 미세 특징을 분석하는 것이 어렵다.
인체 조직 또는 동물 모델에서 병리학의 평가, 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 컬러 포함 된 포름 알데히드 고정 파라핀 섹션 (FFPE) TIS의 병리학 적 분석을 위해고소는 표준입니다. 간단한 외에 H & E 염색 immunolabeling는 병리학 적 이상을 식별하기 위해 수행된다. 이러한 조직은 EM 수준, 특정 세포 유형에서 분석 될 수 있다면 세포 내 변화가 확인 될 수있다. 대규모 EM의 편견 특성은 질병의 예상치 못한 새로운 특징을 발견 할 수 있습니다. 대규모으로 평방 밀리미터 EM 영역까지를 시각화 할 수 있습니다. 우리와 다른 이전에 췌장 섬 4 쥐 위해 nanotomy, 세포 배양 2, 쥐의 뇌 (3), 피부 및 점막 7 및 전체 제브라 피쉬 애벌레 1.5을 (www.nanotomy.org) 적용. 제브라 피쉬의 뇌 면역 세포 (11)을 포함한 포유 동물 조직에서 접근하기 어려운 세포 유형을 시각화 특히에서, 생체 내 이미징에 매우 적합하다. 여기 nanotomy 절차에 의한 신경 메트로니다졸 변환하여 조건부 신경 절제술을받은 제브라 헤드의 관상 부에인가 상세히 설명표현 nitroreductase (www.nanotomy.org) 5,12-14. 모든 원시 데이터는 조직의 규모 변화에 분자 시각화, 줌 가능 HTML 파일로 제공됩니다. 원시 데이터의 발표는 전 세계적으로 전문가에 의해 다른 각도에서 데이터 세트의 편견 분석을 할 수 있습니다.
EM은 생물 학적 맥락에서 거대 분자의 고해상도 이미지와 휴대 맥락의 분석을 할 수 있습니다. 그러나, 이것은 통상적으로 시야를 제한한다. 대규모 3D EM 복잡한 데이터 처리를 요구하는 10 나노 스케일 해상도 3 차원 재구성을 만들어 매핑 신경 연결에 특히 적합하다. 대조적으로, 2D 대규모 EM는 촬상 데이터의 하나의 부분과 스티치를 요구하고, 상기 데이터의 평가는 인터넷 브라우저에 대한 액세스를 누구라도 가능하다. 우리와 다른 이전에 조직과 전체 동물을 분석하기 위해 대규모 EM을 사용했다. 가장 접근, TEM 및 SEM 기반 바느질에 관해서는 자신의 장점을 가지고 않습니다. 여기서, 스캔 전송 EM (STEM)은 높은 해상도로 넓은 시야의 생성을 허용하는 사용되었다. 큰 한 느낌을 묘화 할 때 일반적으로 하나의 STEM 이미지는 대략 100 TEM 이미지를 크게 스티치의 양을 감소시키는 관점 분야에 해당높은 해상도에서보기 DS. 높은 해상도가 필요한 경우, TEM 유리할 수있다. STEM 비 대조 샘플이 좋은 미세 콘트라스트 6 사용될 수 TEM 이상의 장점을 갖는다.
또한, 여기에 기재된 방법은 단순히 여러 섹션 현미경 시스템의 사용을 확대 실리카 웨이퍼 상에 장착 다시 산란 전자 검출 (BSD)에 사용하기 위해 조정될 수있다. HTML-줌 가능 조직 EM 파일은 환자 데이터를 분석, 과학 연구 LM 및 EM 데이터 (클레멘 타인) 8, 프리젠 테이션 목적을 결합, 그 전체 내용 분석되지 않았을 수 있습니다 데이터를 공유하고, 교육, 정량 매우 유용하다. BSD가 사용될 수 있고, 더 일반적으로 검출 줄기보다 사형 전자 현미경에 사용 가능하다 : 대안 적으로, SEM 대규모 EM에 있지만 아닌 TEM에 실리카 웨이퍼는 두 가지 장점을 갖고 이용 될 수있다. 둘째, 대형 섹션 (>의 1mm 2 영역으로 설치관심이) 간단합니다. 하나의 슬롯 그리드에 설치하는 것은 노동 집약적 기술적 도전이다. TEM, SEM 및 STEM 사이의 상세 비교는 다른 곳에서 6 자세히 설명되어 있습니다. BSD 영상의 단점은 이미지 잡음 증가 줄기 비교한다는 것이다. 이것은 부분적으로 더 긴 획득 시간의 결과, 화소 체류 시간을 증가시킴으로써 보상 될 수있다.
샘플 준비 상대적으로 표준 EM 처리 (고정, 삽입 및 절편)에 대한 5-7을 필요로하지만,이 유물의 완전히없는 큰 얇은 부분을 잘라 기술적 도전이다. 섹션은 쉽게 깰 매우 연약 접거나 일반적으로 데이터 세트에 따라 여러 시간이 소요 영상 중에 파괴된다. 그러나, 원시 바이어스 데이터의 온라인 공유, 그것은 문서 데이터를 쉽게 비교하고, 컨트롤과 같은 개방 도메인 문서 셋을 사용하는 것이 가능해질 것이다. 현재 할 수있는 라 몇 EM 장치RGE 규모 분석을 사용하고, 대부분의 이미징 센터가 공동 노력을 환영하지만, 따라서이 기술에 대한 접근성은 다소 제한됩니다.
대규모 섹션의 조직이 제대로 샘플은 고정되어야한다. 즉 빠르지 만 적당한 정착 PFA의 혼합물이 느리지 만 강한 정착액 GA와 병용되는 이유이다. 절단과 유물없이 큰 부분을 따기 것은 어려운 일이다. BSD와 함께 웨이퍼 작업은 하나의 구멍 격자에 섹션을 수집에 비해 쉽다. 중금속 후 염색 고전 EM에 비해 더 중요하다. 전체 부분이 몇 군데 있기 때문에 모든 이슈가 표시됩니다. TEM 사용자가 일반적으로 어려운 때문에 현미경 동작의 차이 중, SEM으로 전환 발견.
정량 및 데이터 공유 – 세포 내 기능을 정량화하는 단일 EM 이미지에 어렵다. 가능성과 대규모의 축소이미지는 쉽게 세포 내부의 나노 측정에 의해 올 수 있습니다 관심의 세포를 식별 할 수 있습니다. 이 데이터 세트는 특정 세포 유형이 빠르게 다른 규모에서 검출 기능에 따라, 식별하고 이러한 큰 조직 섹션에 공정한 방식으로 정량화 될 수 있음을 나타냅니다. 예를 들어, 미세 아교 세포들은 형태와 치밀한 세포질에 기초하여 식별 될 수있다. 우리는 이전에 대규모 EM 조직 배양 데이터 세트 (2) 내에 ER의 폭 켰을 때, 계속해서, 각 셀의 확대에 따라, 이들 세포의 세포 내 분자 나노 기능은 동일한 세트 내에서 측정 할 수있다. nanotomy의 또 다른 장점은 온라인 대규모 데이터 세트의 호스팅하는 다른 사람이 어쩌면 다른 기능에 대한 데이터를 검사 할 수 있도록, 새로운 가설에 자신의 결론을 도출하는 것입니다.
클레멘 타인은 – 정량적 EM 촉진뿐만 아니라, 대규모 EM보다 쉽게 광 microsco를 상관하게EM 레벨 8 그림 라벨링. 본 예에서 제브라 절제 모델 식세포 미세 아교 세포의 존재를 나타낸다. 신경 과학에서 중요한 문제는 각각의 기능과 기여가 미세 아교 세포와 대 식세포와 면역 세포의 잠재적 인 다른 소스의 무엇이다. 초기 EM 연구는 질병 (18)에 미세 아교 세포의 독특한 세포 내 기능을 보여 주었다. 그들은 유전자 발현 형태와 기능의 다른 면역 세포와 큰 오버랩을 나타낸다 불행히도, 선택적으로 병리 적 환경에서 특히 미세 아교 라벨 어렵다. 따라서, 불분명 여부와 미세 수준에서 미세 아교 세포는 대 식세포에 침투 유래 단핵구를 포함하여 다른 소스에서 면역 세포와 다를 경우. 기능 차이의 분석을위한 시작점을 제공 이러한 미세 셀 사이의 차이가 있는지 이해. 선택적 형질 전환 또는 식 마커를 조합과 클레멘 타인은 DET 수 있습니다미세 기능 ection 특정 집단에 선택적.
진단 및 프리젠 테이션과 교육 – 하나의 데이터 세트 EM 데이터 내에서 마이크로에 나노를 시각화함으로써 크게 폭 넓은 관객들에게 용이하게된다. 상관 대규모 EM의 증가 가능성과 도구를 우리는 기본 및 의학 연구에 EM의 부흥을 기대하고 있습니다. 여기에 표시되는 우리의 방법은 제브라 뇌 손상 모델 (5)에인가되지만, 당뇨병 4 및 세포 배양 2의 쥐 모델에서 인체 조직 7, 래트 뇌 (3)에 사용되고, 또한 TEM과 조합하여 사용될 수있다 이 방법의 다양성을 보여주는 기반 접근 방식 1. 현미경 연산자는 더 이상 높은 선택하지, 따라서 바이어스 이미지,하지만 모든 다수의 미세 기능은 기록 및 전 세계 분석을위한 오픈되어 녹음됩니다.
The authors have nothing to disclose.
작품의 대부분은 NWO 175-010-2009-023 및 ZonMW 91111006 후원하는 UMCG 현미경 및 이미징 센터 (UMIC)에서 수행되었다; BNGG에 STW "현미경 밸리 12718". 이 작품은하는 마리 퀴리 경력 통합 보조금 (신경 세포 죽어 저장)를 ZonMW VENI 부여 및 TJvH에 알츠하이머 네덜란드의 교제에 의해 후원
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |