Isolering af leukocytter fra musehud anvendelse af enzymatiske Digest og Gradient Separation

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Hudlidelser lige fra kontakteksem, eksem, psoriasis, cellulitis, svampeinfektioner og bylder til ikke-melanom hudkræft viste sig at være blandt de 50 mest udbredte sygdomme i hele verden, og den fjerde førende årsag til ikke-dødelige sygdomme i ²⁰¹⁰ 1. Derfor undersøgelse af molekylære og cellulære mekanismer bag diverse hud patologier er en nødvendig og aktivt forskningsområde. Gnavermodeller har været bemærkelsesværdigt nyttige i forståelsen af inflammatoriske hudtilstande, såsom atopisk dermatitis ^2, psoriasis ³ eller Staphylococcus aureus infektion ^4. Billige, effektive og simple protokoller for enzymatisk fordøjelse af muse hudvæv kan give præparater af celler, som kan anvendes til en række af downstream-applikationer for bedre at forstå patofysiologien af ​​hudsygdomme. Her er en enkel og økonomisk fremgangsmåde beskrevet for enzymatisk fordøjelse af musehudvæv og isolering af hud infiltrerende leukocytter, som kan anvendes til celledyrkning, in vivo adoptiv overførsel, flowcytometrisk analyse og sortering eller genekspressionsstudier. Det overordnede mål med denne procedure er at forberede en enkelt celle suspension af hud-infiltrerende leukocytter med høj cellelevedygtighed samtidig minimere omkostningerne typisk er forbundet med brugerdefinerede reagenskits og mekaniske dissociators.

Eksisterende hud væv dissociation metoder ^5-7 kan resultere i lav levedygtighed og overfladen cellemarkør integritet, eller kræve brugerdefinerede enzym kits og dyre væv dissociation maskiner ^8-11. Mens fordøjelsen af museøre hudvæv er rimeligt udbredt ^12-13, fordøje meget keratiniseret hudvæv (fx fra flanken) kan resultere i cellepræparationer forurenet med store mængder af ikke-celleaffald. I en nylig undersøgelse, Zaid og kolleger fordøjet mus flanke huden i 90 min i 2,5 mg / ml dispase, følgenwed med 45 minutter i 3 mg / ml collagenase ^7. I en anden undersøgelse, disse forskere anvendes flere inkubationer med en samlet fordøjelse af 2,5 timer, herunder anvendelse af trypsin / EDTA, collagenase III og dispase ^5. Anvendelsen af trypsin anbefales ikke til enzymatisk fordøjelse hud, som er blevet vist behandling med trypsin fra forskellige producenter til målbart påvirke integriteten af celleoverfladeproteiner på pattedyrceller ^14-15. Derudover kan dispase få væsentlig indvirkning på proliferative evner CD4 og CD8a T-celler og påvirke overflade overflod af mindst 20 molekyler, herunder fælles T-celle aktivering markører såsom CD62L ^16. Andre protokoller anvender RPMI 1640 i fordøjelsen medium ^6. Tilstedeværelsen af ^Mg2 + og ^Ca2 + i RPMI, kan imidlertid forårsage omfattende celleaggregering ^17.

En ideel protokol for væv dissociation bør sigte efter høj cellelevedygtighed, lavniveauer af celleaggregering og minimal skade på celleoverfladeproteiner. Høj kvalitet lymfeknude stromale celle forberedelser er opnået med protokoller, der bruger kortere enzym inkubationer, Ca ²⁺ og Mg ²⁺ frie medier, og undgå trypsin og Dispase ^18. Det er imidlertid ikke blevet etableret protokoller af denne type for dissociation af hele musehud.

Her en protokol beskrevet til at dissociere, isolere, og berige hud-infiltrerende leukocytter fra allergen-udfordrede mus flanke hud. Kort fortalt, udskåret hud er præinkuberet i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) med 10% føtalt bovint serum i 1 time for at blødgøre væv til fordøjelsen og fjerne overskydende døde hud eller fedtvæv. Dette efterfølges af en 30 min enzymatisk fordøjelse takt med 0,7 mg / ml collagenase D. Collagenase D har minimale virkninger på tætheden af celleoverflademarkører, og ingen virkning på T-celleproliferation in vitro ^16,18, hvilket gør detsærdeles velegnet til anvendelser, der involverer karakterisering af overfladeproteiner. Efter enzymatisk nedbrydning blev diskontinuerlig densitetsgradientcentrifugering anvendes til at fjerne epitelceller og rester fra encellede suspension og berige for hæmatopoietiske celler. Det er vigtigt, denne procedure undgår dyre kolonne-baserede magnetiske cellesepareringspræparater reagenser og væv dissociation maskiner ^8-11, og kan udføres med udstyr og materialer, der findes i en grundlæggende biomedicinsk forskning laboratorium. Her blev denne protokol, der bruges til at isolere leukocytter fra flanken hud udfordret tre gange med haptenet oxazolon (Ox) i tidligere sensibiliserede ND4 Swiss mus (tilpasset fra 19). Celler blev analyseret ved anvendelse af multi-parametrisk flowcytometri. Denne teknik gav en cellesuspension med minimal snavs og> 95% levedygtighed isolerede lymfocytter, som blev analyseret ved multi-parametrisk flowcytometri til måling af infiltration af T-lymfocytter og neutrofiler i de berørte ski.

Protocol

Bemærk: 8-12 uger gamle kvindelige ND4 Swiss Webster mus, konventionelt opstaldet med fri adgang til mad og vand, blev anvendt til disse undersøgelser Den eksperimentelle protokol, der bruges (B13S1) blev godkendt af Macalester akademiets IACUC.. 1. sensibilisering og udsættelse for oxazolon Dag 0 Forbered anæstesi kammer ved tilsætning af 3 ml isofluran absorberende håndklæder placeret under mesh nederst på en 4 L låg glaskrukke. For ND4 hunmus anvendes her, tid i kammeret …

Representative Results

Collagenase D behandlede splenocytter viser lignende niveauer af CD4 og CD8 α på T-celler i forhold til medierne-behandlede kontroller Først blev den eventuelle påvirkning af collagenase D om hyppigheden og overflade overflod af afstamning og aktivering markører på T-celle delmængder vurderet ved hjælp sekundær lymfoide væv som kontrol. En suspension af splenocytter blev opnået fra ND4 mus og vasket i 1 time med HBSS me…

Discussion

Karakterisering forandringer i hud-resident leukocytter i gnavermodeller for hudsygdomme, såsom atopisk dermatitis eller psoriasis er vigtige for forståelsen af ​​mekanistiske forbindelser mellem inflammatorisk celleindstrømning og sygdom patologi. Her beskriver vi en økonomisk teknik til at isolere leukocytter fra hud væv med basisudstyr findes i de fleste biomedicinske forskningslaboratorier. Denne relativt hurtige teknik undgår brugen af ​​dyre væv dissociation maskiner og brugerdefinerede rør og reag…

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium salt solution	Sigma Aldrich	E7889	Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice	Harlan	0-32	8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines.