Isolatie van Infiltrating leukocyten uit Mouse huid met behulp van enzymatische Digest en Gradient Scheiding

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Huidaandoeningen, variërend van contact dermatitis, eczeem, psoriasis, cellulitis, schimmelinfecties en abcessen op non-melanoma huidkanker bleken te zijn van de 50 meest voorkomende ziekten in de wereld, en de vierde toonaangevende wereldwijde oorzaak van niet-dodelijke ziekten in 2010 ^1. Dienovereenkomstig, het onderzoek van de moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan diverse huid pathologieën is een noodzakelijke en actieve gebied van onderzoek. Knaagdiermodellen opmerkelijk bruikbaar zijn bij het ​​begrijpen van inflammatoire huidaandoeningen geweest zoals atopische dermatitis ^2, psoriasis ³ of Staphylococcus aureus infectie ^4. Goedkoop, efficiënt, eenvoudig en protocollen voor de enzymatische vertering van muizenhuid weefsel van cellen die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van downstreamtoepassingen beter begrip van de pathofysiologie van huidziekten verschaffen. Hier wordt een eenvoudige en economische werkwijze beschreven voor enzymatische digestie van muizenhuidweefsel en isoleren van huid-infiltrerende leukocyten die kunnen worden gebruikt voor celkweek, in vivo adoptieve overdracht, flow cytometrische analyse en sortering of gene expression studies. Het algemene doel van deze procedure is om een ​​enkele celsuspensie van huid-infiltrerende leukocyten te bereiden met een hoge levensvatbaarheid van de cel terwijl het minimaliseren van de kosten doorgaans geassocieerd met aangepaste reagens kits en mechanische dissociators.

Bestaande huidweefsel dissociatie methoden ^5-7 kan resulteren in lage levensvatbaarheid en oppervlakte celmerker integriteit, of eisen aangepaste enzym kits en dure weefsel dissociatie machines ^8-11. Terwijl de vertering van muizenoor huidweefsel redelijk gangbaar ^12-13, verteren sterk verhoornde huidweefsel (bijvoorbeeld van de flank) kan resulteren in celpreparaten verontreinigd met grote hoeveelheden niet-cellulair afval. In een recente studie, Zaid en collega verteerd muis flank huid gedurende 90 min in 2,5 mg / ml dispase, followed door 45 min bij 3 mg / ml collagenase ^7. In een andere studie, deze onderzoekers gebruikte meervoudige incubaties met een gecombineerde digestie van 2,5 uur, inclusief het gebruik van trypsine / EDTA, collagenase III en dispase ^5. Het gebruik van trypsine wordt niet aanbevolen voor de huid enzymatische digestie, zoals behandeling met trypsine van verschillende fabrikanten heeft aangetoond dat meetbaar invloed op de integriteit van celoppervlakeiwitten op zoogdiercellen ^14-15. Bovendien kan dispase aanzienlijk proliferatieve vermogen van CD4 en CD8a T cellen en beïnvloeden oppervlakte overvloed van ten minste 20 moleculen met gemeenschappelijke T cel activatie merkers zoals CD62L ^16. Andere protocollen RPMI 1640 in digestiemedium ^6. Echter, de aanwezigheid van ^Mg2 + en ^Ca2 + in RPMI uitgebreide celaggregatie ¹⁷ veroorzaken.

Een ideale protocol voor het weefsel dissociatie moeten streven naar een hoge levensvatbaarheid van de cellen, laagniveaus van cel- aggregatie en minimale schade aan oppervlakte-eiwitten cel. Hoge kwaliteit lymfeklier stromale cel voorbereidingen zijn bereikt met protocollen die kortere enzymincubaties, Ca ²⁺ en Mg ²⁺ vrije media te gebruiken, en trypsine te vermijden en Dispase ^18. Echter protocollen van dit type niet vastgesteld voor de dissociatie van hele muizenhuid.

Hier wordt een protocol beschreven te distantiëren, te isoleren en te verrijken huid-infiltrerende leukocyten uit-allergeen uitgedaagd muis flank huid. In het kort uitgesneden huid gepreïncubeerd in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met 10% foetaal runderserum gedurende 1 uur aan het weefsel voor de spijsvertering te verzachten en verwijderen van overtollige dode huid en vetweefsel. Dit wordt gevolgd door een 30 min enzymatische digestie stap met 0,7 mg / ml collagenase D. collagenase D heeft minimale effecten op de dichtheid van celoppervlak markers, en geen effect op T-celproliferatie in vitro ^16,18, waardoor hetzeer geschikt voor toepassingen in de karakterisering van oppervlakte-eiwitten. Na enzymatische digestie, werd discontinue dichtheidsgradiënt centrifugatie gebruikt epitheelcellen en vuil van de eencellige suspensie te verwijderen en te verrijken voor hematopoïetische cellen. Belangrijk is dat deze procedure vermijdt dure kolommen gebaseerde magnetische celscheiding reagentia en weefsels dissociatie machines ^11/08, en kan worden uitgevoerd met apparatuur en materialen die in een fundamenteel biomedisch onderzoekslaboratorium. Hier werd dit protocol dat wordt gebruikt om leukocyten te isoleren van de flank huid uitgedaagd drie keer met het hapteen oxazolon (Ox) in eerder gevoelig ND4 Zwitserse muizen (aangepast van 19). Cellen werden geanalyseerd met behulp van multi-parametrische flowcytometrie. Deze techniek leverde een celsuspensie met minimale puin en> 95% levensvatbaarheid van de geïsoleerde lymfocyten die werden geanalyseerd door multi-parametrische flowcytometrie om de infiltratie van T-lymfocyten en neutrofielen te meten in de getroffen skin.

Protocol

Let op: 8-12 weken oude vrouwelijke ND4 Zwitserse Webster muizen conventioneel gehuisvest met vrije toegang tot voedsel en water, werden gebruikt voor deze studies Het experimentele protocol gebruikt (B13S1) werd goedgekeurd door Macalester College IACUC.. 1. Sensibilisering en Challenge met Oxazolon Dag 0 Bereid anesthesie kamer door toevoeging van 3 ml isofluraan absorberende handdoeken geplaatst onder maas onderaan een 4 L deksel glazen pot. Voor de ND4 vrouwelijke muizen die hier…

Representative Results

Collagenase D behandelde miltcellen vertonen gelijkaardige niveaus van CD4 en CD8 α op T-cellen in vergelijking met media-behandelde controles Ten eerste, de mogelijke gevolgen van collagenase D van de frequentie en oppervlakte overvloed aan afstamming en activatie merkers op T-cel subsets werden beoordeeld met behulp van secundaire lymfoïde weefsel als controle. Een suspensie van splenocyten verkregen uit ND4 muizen en gewassen…

Discussion

Het karakteriseren van veranderingen in de huid-ingezeten leukocyten in knaagdiermodellen van huidziekten, zoals atopische dermatitis of psoriasis is van belang voor het begrijpen van mechanistische verbindingen tussen inflammatoire cel instroom en de ziekte pathologie. Hier beschrijven we een voordelige techniek om leukocyten uit huidweefsel te isoleren met basisuitrusting gevonden in de meeste biomedisch onderzoek labs. Deze relatief snelle techniek vermijdt het gebruik van dure weefsel dissociatie machines en aangepa…

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium salt solution	Sigma Aldrich	E7889	Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice	Harlan	0-32	8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines.