Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
Hauterkrankungen, die von Kontaktdermatitis, Ekzem, Schuppenflechte, Zellulitis, Pilzinfektionen und Abszesse, um Nicht-Melanom-Hautkrebs wurden gefunden, um unter den 50 häufigsten Krankheiten weltweit zu sein, und die vierte weltweit führende Ursache für nicht-tödlichen Krankheiten im Jahr 2010 1. Dementsprechend ist die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen vielfältige Hautpathologien ist ein notwendiger und aktives Forschungsgebiet. Nagetiermodellen haben im Verständnis von entzündlichen Hautzuständen bemerkenswert nützlich gewesen wie atopische Dermatitis 2, Psoriasis 3 oder Staphylococcus aureus Infektion 4. Kostengünstige, effiziente und einfache Protokolle für die enzymatische Verdauung von Maushautgewebe kann Zubereitungen von Zellen, die für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann, um die Pathophysiologie von Haut Krankheiten besser zu verstehen. Hier ist ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Mäusehaut beschriebenGewebe und die Isolierung von Haut infiltrierenden Leukozyten, die für die Zellkultur, in vivo adoptiven Transfer genutzt werden können, durchflusszytometrische Analyse und Sortierung oder Genexpressionsstudien. Das übergeordnete Ziel dieser Vorgehensweise ist, um eine Einzelzellsuspension aus haut infiltrieren Leukozyten mit hoher Zelllebensfähigkeit vorzubereiten, während die Kosten in der Regel mit eigenen Reagenzien-Kits und mechanische dissociators assoziiert zu minimieren.
Bestehende Hautgewebe Dissoziation Verfahren 5-7 können in geringen Zelllebensfähigkeit und Oberflächenmarker Integrität führen oder erfordern kundenspezifische Enzym-Kits und teuer Gewebedissoziation Maschinen 8-11. Während der Verdauung der Mausohr Hautgewebe ist recht verbreitet 12-13, Verdauen stark verhornte Hautgewebe (zB von der Flanke) in Zellpräparaten mit großen Mengen an nicht-Zelltrümmer kontaminiert führen. In einer aktuellen Studie, Zaid und Kollegen verdaut Maus Flankenhaut für 90 Minuten in 2,5 mg / ml Dispase, Follovon 45 min in 3 mg / ml Kollagenase 7 vermählen. In einer anderen Studie verwendet diese Forscher mehreren Inkubationen mit einem kombinierten Aufschluss von 2,5 Stunden, einschließlich der Verwendung von Trypsin / EDTA, Collagenase III und Dispase 5. Die Verwendung von Trypsin ist nicht für die enzymatische Verdauung Haut empfohlen, da die Behandlung mit Trypsin von verschiedenen Herstellern wurde gezeigt, meßbar beeinflussen die Integrität von Zelloberflächenproteinen auf Säugetierzellen 14-15. Zusätzlich kann Dispase signifikante Wirkungen auf proliferative Fähigkeit der CD4 T-Zellen und CD8a auswirken und Oberflächenfluss von wenigstens 20 Molekülen, einschließlich der gemeinsamen T-Zellaktivierung Marker wie CD62L 16. Andere Protokolle verwenden RPMI 1640 bei der Verdauung Medium 6. Jedoch kann die Anwesenheit von Mg 2+ und Ca 2+ in RPMI verursachen umfangreiche Zellaggregation 17.
Ein ideales Protokoll für Gewebedissoziation sollte für Hochzelllebensfähigkeit, geringe zielenEbenen der Zellaggregation und minimale Beschädigung Oberflächenproteine zu Zelle. Hochwertige Lymphknoten Stromazellen Vorbereitungen mit Protokollen, die kürzer Enzyminkubationen, Ca 2+ und Mg 2+ freien Medien zu verwenden erreicht worden, und Trypsin zu vermeiden und Dispase 18. Jedoch haben Protokolle dieser Art nicht für die Dissoziation von ganzen Mäusehaut nachgewiesen.
Hier wird ein Protokoll beschrieben zu distanzieren, zu isolieren und zu bereichern haut infiltrieren Leukozyten aus allergenfochten Maus Flanke Haut. Kurz gesagt, herausgeschnitten Haut in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10% fötalem Rinderserum für 1 Stunde vorinkubiert, um das Gewebe für die Verdauung zu erweichen und zu entfernen überschüssiges tote Haut oder Fettgewebe. Dies wird durch eine 30 min enzymatischen Aufschlußschritt mit 0,7 mg gefolgt / ml Kollagenase D. Kollagenase D hat minimale Auswirkungen auf Dichte der Zelloberflächenmarker und keine Wirkung auf die T-Zellproliferation in vitro 16,18, so dass essehr gut geeignet für Anwendungen, die die Charakterisierung von Oberflächenproteinen. Folgende enzymatische Verdauung wurde diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Epithelzellen und Schmutz von der Einzelzellsuspension zu entfernen und anzureichern hämatopoetischen Zellen. Wichtiger ist, vermeidet dieses Verfahren teuer spaltenbasierten Magnetzellseparation Reagenzien und Gewebedissoziation Maschinen 8-11 und können mit Geräten und Materialien in einem basischen biomedizinischen Forschungslabors gefunden geführt werden. Hier wurde dieses Protokoll verwendet, um Leukozyten aus Flankenhaut dreimal herausgefordert mit dem Hapten Oxazolon (Ox) bei bereits sensibilisierten ND4 Swiss Mäuse (ab 19 angepasst) zu isolieren. Zellen wurden unter Verwendung von Mehrparameter Durchflusszytometrie analysiert. Diese Technik ergab eine Zellsuspension mit minimalem Rückstand und> 95% Lebensfähigkeit der isolierten Lymphozyten, die von Mehrparameter Flow-Zytometrie analysiert wurden, um die Infiltration von T-Lymphozyten und Neutrophilen in die betroffene sk messenim.
Protocol
Representative Results
Discussion
Charakterisierung von Veränderungen der Hautansässigen Leukozyten in Nagetiermodellen von Hauterkrankungen wie Neurodermitis oder Psoriasis ist wichtig für das Verständnis der mechanistischen Zusammenhänge zwischen entzündlichen Zell Zustrom und Krankheitspathologie. Hier beschreiben wir eine wirtschaftliche Technik, um Leukozyten aus Hautgewebe mit Grundausstattung in den meisten biomedizinischen Forschungslabors gefunden zu isolieren. Diese relativ schnelle Technik vermeidet die Verwendung von teuren Gewebedisso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die National Institutes of Health (NIH R15 NS067536-01A1 zu DC), der National Vulvodynia Association (Auszeichnung an DC) und Macalester College unterstützt diese Arbeit. CB Im Rahmen eines Stipendiums der Macalester College Beckman Scholars Program, durch das Arnold und Mabel Beckman-Stiftung. BTF und TM werden von JDRF 2-2011-662 unterstützt. Wir danken Dr. Jason Schenkel und Dr. Juliana Lewis für die technische Beratung, und alle aktuellen und ehemaligen Mitglieder des Chatterjea Labor für ihre Hilfe und Unterstützung.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
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