酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
皮膚接触性皮膚炎、湿疹、乾癬、蜂巣炎、真菌感染症および膿瘍からの非黒色腫皮膚癌が世界50最も一般的な疾患の一つであることが判明した範囲の条件、および2010年1における非致死的疾患の第四世界的なリーディング原因。したがって、多様な皮膚の病変の基礎となる分子・細胞メカニズムの研究は、研究の必要と活性領域です。げっ歯類モデルは、アトピー性皮膚炎2、乾癬3、または黄色ブドウ球菌感染 4のような炎症性皮膚状態の理解に非常に有用でした。マウスの皮膚組織の酵素消化のための、安価で効率的、かつ簡単なプロトコルは、優れた皮膚疾患の病態生理を理解するために、下流の様々な用途に使用することができる細胞の調製物を提供することができます。ここでは、簡単かつ経済的な方法は、マウスの皮膚の酵素消化のために記載されています組織および細胞培養、in vivoでの養子移入のために使用することができる皮膚浸潤白血球の単離は、サイトメトリー分析および選別または遺伝子発現研究を流します。この手順の全体的な目的は、典型的には、カスタムの試薬キットや機械的解離剤に関連するコストを最小限に抑えながら、高い細胞生存率で皮膚浸潤白血球の単一細胞懸濁液を調製することです。
既存の皮膚組織解離方法5-7は、低細胞生存率および表面マーカーの完全性をもたらす、またはカスタム酵素キットや高価な組織解離機8-11が必要な場合があります。マウス耳皮膚組織の消化は、合理的に、12-13流行高度角化皮膚組織を消化し ている間（例えば、サイドから）非細胞破片の大量の汚染された細胞調製物をもたらすことができます。最近の研究では、ザイドらは、2.5 mg / mlのディスパーゼ、follo 90分間マウスの脇腹の皮膚を消化しました3 mg / mlのコラゲナーゼ7で45分までに結婚。別の研究では、これらの研究者は、トリプシン/ EDTA、コラゲナーゼIIIの使用を含む、2.5時間の組み合わせ消化で複数のインキュベーションを使用し、5をディスパーゼ。異なる製造業者からのトリプシン処理は、測定可能な哺乳動物細胞の14-15上の細胞表面タンパク質の完全性に影響を与えることが示されているようにトリプシンの使用は、皮膚の酵素消化には 推奨されません。さらに、ディスパーゼは、CD4およびCD8αT細胞の増殖能力に有意な効果を有しており、例えば、CD62L 16などの一般的なT細胞活性化マーカーを含む少なくとも20の分子の表面の存在量に影響を与えることができます。他のプロトコルは、消化媒体6に RPMI 1640を使用しています。しかし、RPMI中のMg 2+およびCa 2+の存在は、大規模な細胞凝集17を引き起こす可能性があります 。
組織解離のための理想的なプロトコルは、低、高細胞生存率を目指す必要があります細胞凝集、および細胞表面タンパク質への最小限の損傷のレベル。高品質のリンパ節間質細胞調製物は、短い酵素インキュベーション、 の Ca 2+およびMg 2+を含まない培地を使用するプロトコルを用いて達成し、トリプシンを回避し、18をディスパーゼされています。しかし、このタイプのプロトコルは、全マウス皮膚の解離のために確立されていません。
ここでは、プロトコルは、解離分離、およびアレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚から皮膚浸潤白血球を豊かにするために記載されています。簡単に説明すると、切除された皮膚は、消化のために、組織を柔らかくし、余分な死んだ皮膚または脂肪組織を除去するために、1時間、10％ウシ胎児血清を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）中でプレインキュベートします。これは、0.7ミリグラムで30分間酵素消化工程が続く/ mLのコラゲナーゼD.コラゲナーゼDはそれを作る、細胞表面マーカーの密度、 およびインビトロ16,18 における T細胞の増殖に影響を与えずに最小限の効果を有します表面タンパク質の特徴付けを含む用途に非常に適しています。酵素消化の後、不連続密度勾配遠心分離は、単一細胞懸濁液からの上皮細胞及び破片を除去し、造血細胞を富化するために使用しました。重要なことには、この手順は、高価なカラムベースの磁気細胞分離試薬および組織解離機8-11を回避し 、かつ基本的な生物医学研究室で見つけ機材を用いて行うことができます。ここでは、このプロトコルは、脇腹皮膚から白血球を分離するために使用された（19から適応）以前に増感ND4のスイスマウスにハプテンオキサゾロン（OX）で3回挑戦しました。細胞を、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いて分析しました。この技術は、最小限の破片と、影響を受けたSKにTリンパ球および好中球の浸潤を測定するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって分析された、単離されたリンパ球の> 95％の生存率と細胞懸濁液が得られましたに。
Protocol
Representative Results
Discussion
このようなアトピー性皮膚炎や乾癬などの皮膚疾患のげっ歯類モデルにおいて皮膚常駐白血球の変化を特徴づけることは炎症性細胞の流入および疾患の病理との間に機械的な接続を理解するために重要です。ここでは、ほとんどの生物医学研究室で見つかった基本的な機器を用いて皮膚組織から白血球を分離するために経済的な手法について説明します。この比較的急速な技術は実験台でハ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立衛生研究所（NIH R15 DCへNS067536-01A1）、国家外陰部痛協会（DCへの賞）、およびマカレスター大学は、この作品を支持しました。 CBはアーノルドとメイベルベックマン財団によって資金を供給マカレスター大学ベックマン学者プログラムからのフェローシップを受けました。 BTFとTMはJDRF 2-2011-662によってサポートされています。我々は、技術的な助言のために博士ジェイソン・シェンケル博士ジュリアナ・ルイスに感謝し、彼らの助けと支援のためのChatterjeaラボのすべての現在および元メンバー。
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
