Isolamento de leucócitos de infiltração de rato pele utilizando digestão enzimática e separação por gradiente

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Doenças da pele que variam de dermatite de contato, eczema, psoríase, celulite, infecções fúngicas e abcessos para cânceres de pele não-melanoma foram encontrados para estar entre as 50 doenças mais prevalentes em todo o mundo, ea quarta causa líder global de doenças não fatais em 2010 ^1. Por conseguinte, a investigação dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes diversas patologias da pele é uma área de investigação activa e necessário. Modelos de roedores têm sido notavelmente útil na compreensão de condições inflamatórias da pele tais como dermatite atópica ^{2, 3} psoríase, ou infecção por Staphylococcus aureus ^4. Protocolos de baixo custo, eficiente, simples e de digestão enzimática dos tecidos da pele do rato podem proporcionar preparações de células que podem ser utilizadas para uma variedade de aplicações a jusante para melhor compreender a fisiopatologia de doenças de pele. Aqui, um método simples e econômica é descrito por digestão enzimática da pele do ratode tecido e isolamento de leucócitos que se infiltram na pele que pode ser utilizado para cultura de células, in vivo, a transferência adoptiva, análise de citometria de fluxo e classificação ou estudos de expressão de genes. O objetivo geral deste procedimento é para preparar uma suspensão única célula de leucócitos infiltrantes da pele com a viabilidade celular elevada, minimizando os custos tipicamente associados a custom kits de reagentes e dissociadores mecânicos.

Métodos existentes de dissociação do tecido da pele ^5-7 pode resultar em baixa viabilidade celular e da superfície integridade marcador, ou requerem kits de enzimas personalizadas e caras máquinas de dissociação tecido ^8-11. Enquanto a digestão do tecido da pele da orelha rato é razoavelmente prevalente ^12-13, digerindo o tecido da pele altamente queratinizadas (por exemplo, a partir do flanco) pode resultar em preparações de células contaminadas com grandes quantidades de detritos não celular. Em um estudo recente, Zaid e colegas digerido rato pele flanco, durante 90 minutos em 2,5 mg / ml dispase, folloconduzida por 45 min em 3 mg / ml de colagenase ^7. Em outro estudo, estes investigadores usaram várias incubações com uma digestão combinada de 2,5 horas, incluindo a utilização de tripsina / EDTA, colagenase III, e dispase ^5. A utilização de tripsina não é recomendado para a digestão enzimática da pele, como o tratamento com tripsina a partir de diferentes fabricantes, tem sido demonstrado que afecta de forma mensurável a integridade de proteínas da superfície celular em células de mamífero ^14-15. Além disso, dispase pode ter efeitos significativos sobre a capacidade proliferativa das células CD4 e CD8u T e afetar a abundância de superfície de pelo menos 20 moléculas, incluindo T comum marcadores de ativação celular, como CD62L ^16. Outros protocolos usar RPMI 1640 no meio de digestão ^6. No entanto, a presença de Mg ²⁺ e Ca ²⁺ em RPMI pode causar agregação extensiva de células ^17.

Um protocolo ideal para a dissociação do tecido deve apontar para a viabilidade celular elevada, baixoníveis de agregação das células, e o mínimo de danos para a célula proteínas de superfície. Alta qualidade preparações de células do linfonodo estromal ter sido realizado com protocolos que utilizam incubações enzimáticas mais curtos, Ca ^{2+ e Mg 2+} meios de comunicação livres e evitar tripsina e dispase ^18. No entanto, não foram estabelecidas protocolos deste tipo para a dissociação da pele inteira do rato.

Aqui, é descrito um protocolo para dissociar, isolar e enriquecer leucócitos infiltrantes de pele desafiados com alergénio pele de ratinho flanco. Resumidamente, pele excisada é pré-incubada em Solução de Sal Equilibrada de Hank (HBSS) com 10% de soro fetal bovino durante 1 h para amaciar o tecido para a digestão e remover qualquer excesso de pele ou tecido gordo morto. Isto é seguido por um passo de 30 min de digestão enzimática com 0,7 mg / mL de colagenase D. colagenase D tem efeitos mínimos sobre a densidade de marcadores da superfície celular, e nenhum efeito sobre a proliferação de células T in vitro, ^16,18, tornando-altamente adequados para aplicações que envolvem a caracterização de proteínas de superfície. A seguir à digestão enzimática, centrifugação descontínua de gradiente de densidade foi utilizada para remover as células epiteliais e os detritos a partir da suspensão de célula única e para enriquecer células hematopoiéticas. Importante, este procedimento evita os reagentes caros de separação baseados em colunas de células magnético e máquinas de dissociação de tecido ^8-11, e pode ser realizada com equipamento e materiais encontrada num laboratório de investigação biomédica de base. Aqui este protocolo foi utilizado para isolar leucócitos de pele flanco desafiados três vezes com o hapteno de oxazolona (OX) em ratos previamente sensibilizados ND4 suíços (adaptado a partir de 19). As células foram analisadas utilizando citometria de fluxo multi-paramétrico. Esta técnica proporcionou uma suspensão de células com detritos mínima e> 95% de viabilidade de linfócitos isolados que foram analisadas por fluxo multiparamétrica de citometria de medir a infiltração de linfócitos T e de neutrófilos para o SK afectadadentro.

Protocol

Nota: os ratos 8-12 semanas de idade do sexo feminino ND4 Swiss Webster, convencionalmente alojados com livre acesso a comida e água, foram utilizados para estes estudos O protocolo experimental utilizado (B13S1) foi aprovado pelo IACUC do Macalester College.. 1. Sensibilização e Desafio com Oxazolona Dia 0 Prepare a câmara de anestesia por adição de 3 ml de isoflurano para toalhas absorventes colocados por baixo da malha na parte inferior de um frasco de 4 L com tampa de vidro…

Representative Results

A colagenase D tratada esplenócitos mostram níveis semelhantes de CD4 e CD8 α em células T, quando comparado com controlos tratados com media Em primeiro lugar, quaisquer efeitos potenciais de colagenase D sobre a frequência e abundância de superfície de linhagem e de ativação marcadores em subpopulações de células T foram avaliados utilizando tecido linfóide secundário como um controle. Uma suspensão de esplenócit…

Discussion

Caracterização alterações em leucócitos-pele residente em modelos de roedores de doenças da pele tais como dermatite atópica ou psoríase é importante para a compreensão de ligações mecânicas entre o influxo de células inflamatórias e a patologia da doença. Aqui nós descrevemos uma técnica econômica para isolar leucócitos de tecido da pele com equipamento básico encontrado na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica. Esta técnica relativamente rápida evita a utilização de máquinas de dis…

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium salt solution	Sigma Aldrich	E7889	Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice	Harlan	0-32	8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines.