Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Summary

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Abstract

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

Introduction

Кожные начиная от контактного дерматита, экземы, псориаз, целлюлит, грибковых инфекций и абсцессов к раку кожи немеланомных оказались среди 50 самых распространенных заболеваний во всем мире, и четвертый ведущий мировой причиной несмертельных болезней в 2010 году ^1. Соответственно, исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе различных патологий кожи является необходимым и активной областью исследований. Моделях грызунов были чрезвычайно полезны в понимании воспалительных заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз ^{2 3, или} золотистого стафилококка инфекции ^4. Недорогие и эффективные, простые и протоколы для ферментативного переваривания ткани кожи мыши может предоставить препараты клеток, которые могут быть использованы для различных последующих применений, чтобы лучше понять патофизиологию заболеваний кожи. Здесь, простым и экономичным описан способ ферментативного гидролизата кожу мышиткани и выделение кожи лейкоцитов, что проникающих могут быть использованы для культивирования клеток, в естественных приемных передачи, анализа проточной цитометрии и сортировки или исследования экспрессии генов. Общая цель этой процедуры заключается в подготовке единой клеточной суспензии кожи инфильтрирующие лейкоцитов с высокой жизнеспособностью клеток при минимальных затратах, как правило, связанные с наборами реагентов на заказ и механических dissociators.

Существующие методы кожной ткани диссоциации ^5-7 может привести к низкой жизнеспособности клеток и поверхностных маркеров целостности, или требовать пользовательские наборы ферментов и дорогие ткани диссоциации машины ^8-11. В то время как переваривание мыши уха ткани кожи является достаточно распространенным ^12-13, переваривая очень ороговевшей ткани кожи (например, с фланга) может привести к подготовке клеток зараженных с большим количеством неклеточным мусора. В недавнем исследовании, Заид и его коллеги усваивается мыши фланговый кожу в течение 90 мин в 2,5 мг / мл диспаза, Folloво главе с 45 мин в 3 мг / мл коллагеназы ^7. В другом исследовании, эти исследователи использовали несколько инкубации с комбинированным переваривания 2,5 ч, в том числе использование трипсина / EDTA, коллагеназы III и диспаза ^5. Применение трипсина не рекомендуется для ферментативного расщепления кожи, а лечение с помощью трипсина от разных производителей, как было показано заметно влияет на целостность белков клеточной поверхности на клетках млекопитающих ^14-15. Кроме того, диспаза может иметь значительное влияние на пролиферативные способностей CD4 и CD8α Т-клеток и влияет на поверхности изобилие, по крайней мере 20 молекул, в том числе маркеров общего Т активации клеток, таких как CD62L ^16. Другие протоколы используют RPMI 1640 в среде пищеварения ^6. Тем не менее, наличие ^Mg 2+ и ^Ca 2+ в среде RPMI может вызвать агрегацию клеток обширные ^17.

Идеальный протокол для ткани диссоциации должны стремиться к высокой жизнеспособности клеток, низкаяУровни агрегации клеток и минимальным повреждением клеточной поверхности белки. Высокое качество подготовки лимфатических узлов стромальных клеток были выполнены с протоколами, которые используют короткие инкубации фермента, Ca ^{2+ и} Mg ²⁺ свободные средства массовой информации, и избежать трипсина и диспазу ^18. Тем не менее, протоколы этого типа не были созданы для диссоциации всей кожи мыши.

Вот протокол описан отделить, изолировать и обогатить кожу проникают лейкоциты-от аллергена оспаривается мыши фланга кожи. Вкратце, вырезали кожу предварительно инкубировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 1 часа, чтобы смягчить ткань для пищеварения и удаления избытка кожи или мертвую жировую ткань. Это сопровождается 30 мин ферментативного расщепления шага с 0,7 мг / мл коллагеназы Д. коллагеназы D имеет минимальное воздействие на плотность маркеров клеточной поверхности и не оказывает влияния на пролиферацию Т-клеток в пробирке ^16,18, что делает егохорошо подходит для применений, связанных с характеристику поверхностных белков. После ферментативного расщепления, разрывная центрифугирования в градиенте плотности используют для удаления эпителиальных клеток и мусора от одного суспензии клеток и обогащения кроветворных клеток. Важно отметить, что эта процедура позволяет избежать дорогих колонок на основе реагентов разделения магнитного клеток и тканей диссоциации машины ^8-11, и может быть выполнена с оборудованием и материалов, находящихся в основной биомедицинской исследовательской лаборатории. Вот этот протокол был использован для выделения лейкоцитов с фланга кожи оспариваемые три раза гаптена оксазолона (Ox) в ранее сенсибилизированных ND4 швейцарских мышей (взято из 19). Клетки анализировали с помощью многопараметрического проточной цитометрии. Эта методика дала клеточной суспензии с минимальной мусора и> 95% жизнеспособности изолированных лимфоцитов, которые были проанализированы с помощью многопараметрического проточной цитометрии для измерения инфильтрацию Т-лимфоцитов и нейтрофилов в пострадавших SKв.

Protocol

Примечание: 8-12 неделе летняя женщина ND4 Swiss Webster мышей, условно размещены в свободном доступе пищи и воды, были использованы для этих исследований экспериментальный протокол используется (B13S1) был утвержден IACUC Macalester колледжа.. 1. Сенсибилизация и вызов с оксазолоном День 0 <…

Representative Results

Коллагеназа D лечение спленоцитов показывают, что аналогичные уровни CD4 и CD8 альфа на Т-клеток по сравнению с медиа-лечение управления Во-первых, любые потенциальные последствия коллагеназы D от частоты и поверхностной обилие происхожде?…

Discussion

Характеризующий изменение кожных резидентные лейкоцитов в моделях грызунов кожных заболеваний, таких как атопический дерматит и псориаз важно для понимания механистических связей между притоком воспалительных клеток и патологии болезни. Здесь мы опишем экономичный метод, чтобы изо…

Materials

HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid	Sigma Aldrich	55021C	Keep sterile until day of usage.
HEPES, ≥99.5% (titration)	Sigma Aldrich	H3375
EDTA disodium salt solution	Sigma Aldrich	E7889	Keep sterile until day of usage.
Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select	MidSci	S01520HI	Keep sterile until day of usage.
Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C)	Sigma Aldrich	P1644	Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use.
Trimmer Combo Kit	Kent Scientific	CL9990-1201	Use the larger trimmer for shaving the flank and back.
4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one	Sigma Aldrich	E0753-10G	Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate.
Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2)	Tonbo Biosciences	70-0161	Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry
anti-CD3e-BV650 (145-2C11)	Becton Dickinson	564378	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)	eBioscience	47-0042-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD8a-BV785 (53-6.7)	BioLegend	100749	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)	eBioscience	48-0112-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD11c-eFluor450 (N418)	eBioscience	48-0114-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD44-BV711 (IM7)	Becton Dickinson	563971	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45-FITC (30-F11)	Tonbo Biosciences	35-0451-U025	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)	eBioscience	48-0452-80	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)	BioLegend	104431	Antibody used to stain cells for flow cytometry
anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)	BioLegend	108407	Antibody used to stain cells for flow cytometry
Ghost Dye-BV510	Tonbo Biosciences	13-0870-T100	Viability dye for flow cytometry
LSR Fortessa	Becton Dickinson	N/A	Cell analyzer (18 parameters)
Collagenase D from Clostridium histolyticum	Roche Applied Science	11088858001	Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots.  Store immediately at -20°C for up to six months.
ND4 Swiss female mice	Harlan	0-32	8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines.