Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
Kontakt dermatit, egzama, sedef hastalığı, selülit, melanom dışı cilt kanserleri için mantar enfeksiyonları ve apseler arasında değişen cilt koşulları dünya çapında 50 en yaygın hastalıklar arasında olduğu tespit edildi ve 2010 yılında 1 ölümcül olmayan hastalıkların dördüncü önde gelen global neden olur. Buna göre, çeşitli cilt patolojilerin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaların araştırılması araştırma gerekli ve etkin bir alandır. Kemirgen modellerinde, atopik dermatit 2, sedef hastalığı 3 ya da Staphylococcus aureus enfeksiyonu 4 gibi enflamatuar cilt hastalıklarının anlaşılması son derece yararlı olmuştur. Fare deri dokusunun enzimatik sindirimi için, ucuz, etkili ve basit bir protokol daha iyi cilt hastalıklarının patofizyolojisi anlamak için alt çeşitli uygulamalar için kullanılabilir hücre preparatları sağlayabilir. Burada, basit ve ekonomik bir yöntem, sıçan derisine enzimatik sindirimi için açıklanandoku ve hücre kültürü, in vivo adoptif transfer için kullanılabilecek cilt süzücü lökositlerin izolasyonu, sitometrik analizi ve ayırma ya da gen ifade etüdlerinde akar. Bu prosedürün genel amacı, tipik olarak, özel reajan takımına ve mekanik dissociators ile ilişkili maliyetlerin en aza düşürülmesini yüksek hücre canlılığı cilt nüfuz eden lökositler için tek bir hücre süspansiyonu hazırlamaktır.
Mevcut cilt dokusu ayrılma yöntemleri 5-7 düşük hücre canlılığı ve yüzey işaretleyici bütünlüğü neden veya özel enzim kitleri ve pahalı doku ayrılma makineleri 8-11 gerektirebilir. Fare kulak cilt dokusunun sindirim makul 12-13 yaygın yüksek keratinize deri dokusu sindirim ise (örneğin zayıf) hücresel olmayan kalıntı büyük miktarda kirlenmiş hücre hazırlama neden olabilir. Yeni bir çalışmada, Zeyd ve arkadaşları 2.5 mg 90 dakika fare böğür cildi sindirilmiş / ml dispase, Follo3 mg / ml kollajenaz 7 45 dakika ile evli. Başka bir çalışmada, araştırmacılar, bu tripsin / EDTA, kolajenaz III kullanımı da dahil olmak üzere, 2.5 saat bir araya sindirimi ile birden inkubasyon kullanılan ve 5 dispaz. Farklı üreticilerin tripsin ile tedavi ölçülebilir memeli hücreleri 14-15 hücre yüzey proteinlerinin bütünlüğünü etkilediği gösterilmiştir gibi tripsin kullanımı enzimatik cilt sindirimi için tavsiye edilmez. Buna ek olarak, dispaz, CD4 ve CD8α T hücrelerinin çoğalma yetenekleri üzerinde önemli etkilere sahip olabilir ve örneğin CD62L 16 ortak T lenfosit aktivasyonu da dahil olmak üzere, en az 20 moleküllerinin yüzey bolluk etkiler. Diğer protokoller sindirim ortamında 6 RPMI 1640 kullanır. Bununla birlikte, RPMI Mg + 2 ve Ca + 2 varlığı detaylı yuvar toplanmasını 17 neden olabilir.
Doku ayrışma için ideal bir protokol, yüksek hücre canlılığı, düşük hedeflemelidirHücre toplama ve en az zarar seviyesi hücre yüzeyine. Yüksek kaliteli lenf nodu stromal hücre preparatları kısa enzim inkubasyon, Ca 2 + ve Mg 2 + ücretsiz medya kullanımı protokoller ile gerçekleştirilir ve tripsin önlemek ve 18 dispase oylandı. Bununla birlikte, bu tip protokolleri bütün sıçan derisine ayrışması için tesis edilmemiştir.
Burada, bir protokol, ayrışır izole ve alerjen-fare meydan yan yüz derisinden deri süzücü lökositlerin zenginleştirmek için tarif edilmektedir. Kısaca, deri kesilir sindirimi için doku yumuşatmak ve herhangi bir fazla ölü deri ya da yağlı doku kaldırmak için 1 saat süre ile,% 10 fetal bovin serumu içeren Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde önceden inkübe edilir. Bu 0.7 mg ile 30 dakika enzimatik sindirim aşaması izlemektedir / ml kollajenaz D kollajenaz D yapma, en az hücre yüzeyi markerlerinin yoğunluğu üzerindeki etkileri ve in vitro 16,18 T hücresi çoğalması üzerinde bir etkisi yokturyüzey proteinleri karakterizasyonu içeren uygulamalar için son derece uygundur. Enzimatik sindirim takiben, aralıklı yoğunluk gradyan santrifüj tek hücre süspansiyonu epitel hücreleri ve atıklar giderilmiştir ve hematopoietik hücrelerin zenginleştirilmesi için kullanılmıştır. Önemli olarak, bu prosedür pahalı sütunlara göre manyetik hücre ayrıştırma reaktifler ve doku ayrılma makineleri 8-11 önler ve bir bazik biyomedikal araştırmalar laboratuarında bulunan ekipman ve malzeme ile yapılabilir. Aşağıda, bu protokolü (19 uyarlanmıştır) önceden duyarlılaştırılmış ND4 İsviçre farelerinde hapten oksazolon (Ox) ile yan yüz derisinden meydan üç kez lökositleri izole etmek için kullanılmıştır. Hücreler çok parametrik akış sitometri kullanılarak analiz edildi. Bu teknik, minimum enkaz ve sitometri etkilenen sk fazla miktarda T lenfositleri ve nötrofiller infiltrasyonu ölçmek için çok parametre akış sitometrisi ile analiz edilmiştir izole edilmiş lenfositlerin>% 95 canlılık ile bir hücre süspansiyonu elde edildiiçinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Atopik dermatit veya sedef hastalığı gibi deri hastalıklarının, kemirgen modellerinde deri lökositlerin değişiklikleri karakterize enflamatuar hücre influksu ve hastalık patolojisi arasında mekanik bağlantılar anlamak için önemlidir. Burada en biyomedikal araştırma laboratuvarlarında bulunan temel donanımları ile cilt dokusundan lökosit izole etmek için ekonomik bir tekniği açıklar. Bu nispeten hızlı bir tekniktir laboratuarlarında zamanında eller en aza indirerek kaynaklarını korumak iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH DC R15 NS067536-01A1), Ulusal Vulvodini Derneği (DC ödül) ve Macalester College bu işi destekledi. CB Arnold ve Mabel Beckman Vakfı tarafından finanse Macalester College Beckman Scholars Programı, bir burs aldı. BTF ve TM JDRF 2-2011-662 tarafından desteklenmektedir. Biz teknik danışmanlık Dr. Jason Schenkel ve Dr. Juliana Lewis teşekkür ve onların yardım ve destek için Chatterjea laboratuar tüm mevcut ve eski üyeleri.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
