تحسين 2D و 3D الجلد<em> في المختبر</em> نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام
Summary
نقدم بروتوكول للحصول على المصفوفات المشتقة من خلية غنية في البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وذلك باستخدام crowders الجزيئات (MMC). وبالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم البروتوكول الذي يتضمن MMC في 3D عضوي النمط الجيل الجلد ثقافة مشتركة، مما يقلل من الوقت الثقافة مع المحافظة على استحقاق بناء.
Abstract
الأسرة بروتين سكري من الكولاجين تمثل البروتينات الهيكلية الرئيسية في جسم الإنسان، وهي المكونات الرئيسية من المواد الحيوية المستخدمة في هندسة الأنسجة الحديثة. وعنق الزجاجة الفني هو ترسب الكولاجين في المختبر، كما أنها بطيئة بشكل ملاحظ، مما أدى إلى تشكيل دون المستوى الأمثل من النسيج الضام، وتماسك النسيج لاحقا، ولا سيما في نماذج الجلد. هنا، نحن تصف الطريقة التي يتضمن إضافة تفاضلي الحجم السكروز شارك في البوليمرات على الثقافات الجلد لتوليد الجزيئات الازدحام (MMC)، مما يؤدي إلى تعزيز مثيرة من ترسب الكولاجين. بشكل خاص، أودعت الخلايا الليفية الجلدية كمية كبيرة من الكولاجين I / الرابع / السابع والفيبرونكتين تحت MMC بالمقارنة مع مجموعة المقارنة.
يصف بروتوكول أيضا وسيلة لdecellularize طبقات الخلايا المزدحمة، وتعريض كميات كبيرة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) التي تم الإبقاء على سطح الثقافة كما يتضح من immunocytochemistry. تمت دراسة مجمل الكتلة المصفوفة وتوزيع نمط استخدام التدخل انعكاس المجهر. ومن المثير للاهتمام، الخلايا الليفية، الخلايا الكيراتينية وشارك في الثقافات أنتجت المصفوفات المشتقة من خلية (CDM) متفاوتة تكوين والتشكل. آلية التنمية النظيفة يمكن استخدامها باسم "السقالات الحيوي" بذر خلية الثانوي، حيث الاستخدام الحالي من الطلاء أو السقالات، وعادة من مصادر حيوانية xenogenic، يمكن تجنبها، وبالتالي التحرك نحو المزيد من التطبيقات ذات الصلة سريريا.
وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول تطبيق MMC خلال المرحلة المغمور من الجلد نموذج 3D عضوي النمط الثقافة المشتركة التي كانت كافية لتعزيز ECM ترسب في الوصل البشروي الأدمي (DEJ)، على وجه الخصوص، والكولاجين السابع، المكون الرئيسي رسو الألياف. أكد الإلكترون المجهري وجود ترسيخ الألياف في الثقافات المتقدمة مع MMC، مقارنة بمجموعة التحكم. وهذا أمر مهم كما الألياف ترسيخ حبل الأدمة إلى البشرة، وبالتالي،وجود شكل ما قبل النضج DEJ قد يستفيد المتلقين الكسب غير المشروع الجلد من حيث الاستقرار الكسب غير المشروع والتئام الجروح بشكل عام. وعلاوة على ذلك، تم تكثيفه الوقت ثقافة من 5 أسابيع إلى 3 أسابيع للحصول على بناء ناضجة، عند استخدام الوسائط المتعددة، وخفض التكاليف.
Introduction
يشكل الجلد حاجزا واقيا عن طريق منع فقدان الماء ودخول العوامل المسببة للأمراض. وهي مكونة من ثلاثة عناصر رئيسية هي؛ وانسجة الأدمة غنية 1، البشرة طبقية 2،3،4 على أعلى من ذلك، والوصل البشروي الأدمي بين 5،6. وتتكون الأدمة إلى حد كبير من الكولاجين والألياف المرنة وذات كثافة سكانية منخفضة مع الخلايا الليفية 7. في المقابل، وتتكون البشرة خلايا غنية من طبقات متعددة من الخلايا الكيراتينية. الخلايا الكيراتينية من الطبقة الداخلية الأكثر هي التكاثري وتوفر الخلايا القاعدية الجديدة التي تجديد واستبدال الخلايا الكيراتينية التفريق عضال التي تتحرك باستمرار إلى الخارجية، حيث ان معظم طبقة من الجلد وفقدت النواة ومادة هيولية، مما أدى إلى طبقة متقرن الذي يخضع ل التقشر.
تقاطع طريق الجلد، البشرة، نوع معين من الغشاء القاعدي، هو بنية معقدة تتألف من ربط جزيئات المصفوفة، التي tetheRS البشرة إلى الأدمة. ألياف الكولاجين الأول من الأدمة شابك مع الكولاجين السابع ترسو الألياف التي ترتكز على الكولاجين الرابع الصفيحة الغنية الكثيفة. رسو خيوط (laminin 5، والكولاجين السابع عشر وintegrins) بدورها تربط الكثيفة الصفيحة مع hemidesmosomes من الخلايا الكيراتينية القاعدية. الكيراتينية القاعدية (الطبقة القاعدية) لديها القدرة على التكاثر وتجديد، وكذلك يفرق وتطبق على شكل طبقات suprabasal. الشائكة الطبقة، الطبقة الحبيبية، وأخيرا الطبقة القرنية، وهو ما يمثل سطح تلامس الجلد مع البيئة. طريقها من الطبقة القاعدية إلى الطبقة متقرن، الكيراتينية تبديل أنماط التعبير من cytokeratins وأخيرا الخضوع لموت الخلايا المبرمج ويغلف أنفسهم في متقرن المظاريف، هياكل من البروتينات المحددة التي crosslinked تساهميا حسب النشاط الغلوتامين.
إعادة الجلد وطبقات في المختبر، بما في ذلك الهياكل المعقدة لل تقاطع طريق الجلد، البشرة والجلد المصفوفة خارج الخلية، ولمحاكاة عملية التقرن، لديها علماء ومفتون bioengineers دام مهمة صعبة. كانت هناك تقدما كبيرا في هندسة الأنسجة الجلد، على سبيل المثال، استخراج ناجحة من خلايا الجلد من الخزعات المرضى وتوليد الثقافات عضوي النمط الجلد باستخدام خلايا الجلد المستمدة من المريض (8). ومع ذلك، لا تزال المشاكل التي لم تحل الذي يخص لإفراز الفقراء من البروتينات المصفوفة خارج الخلية من خلايا الجلد أنفسهم ومما أدى إلى نماذج الجلد دون المستوى الأمثل. وعلاوة على ذلك، فإن الوقت اللازم لتوليد 3D عضوي النمط الجلد شارك في الثقافة باستخدام البروتوكولات الحالية تتراوح ما بين 4-8 أسابيع، وهي الفترة الزمنية التي يحتمل أن تكون مختصرة مع إدماج crowders الجزيئات. تقليل الوقت اللازم ثقافة ينقذ تكلفة كاشف، ويقلل من حدوث الشيخوخة الخلايا ويقلل من وقت انتظار المريض يجب استخدام المنتج في العيادة.
ر "> الجزيئات الازدحام (MMC) ينطوي على إدخال جزيئات محددة إلى مستنبت لتوليد آثار حجم استبعادها. هذه تؤثر على معدلات التفاعل الأنزيمية بما في ذلك انشقاق بروتين من بروكولاغين وهو تأخر في ظل ظروف ثقافة المائية القياسية 9-13 تحت MMC، التفاعلات الأنزيمية وسارعت دون زيادة كمية الكواشف 14،15 مما أدى، في حالة من الانقسام بروكولاغين، زيادة كمية الكولاجين الأول الجزيئات في الثقافات المزدحمة بالمقارنة مع الضوابط غير مزدحم 10. وتحويل بروكولاغين الكولاجين يسمح تشكيل الكولاجين المجالس، الخلايا الليفية مثقف مع MMC لمدة 48 ساعة حققت أكبر بكثير من الكولاجين أنا بالمقارنة مع الثقافات الليفية غير مزدحم مراقبة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع 11،16،17. وإلى جانب الآثار المترتبة على الأنشطة الأنزيمية التي تؤثر على تكوين وتحقيق الاستقرار وإعادة تشكيل ECM، MMC أيضا وقد تبين لتعزيز مباشرة وتعدل الكولاجينتشكيل الألياف 18،19.نقدم هنا طريقة لتعزيز المصفوفة خارج الخلية (ECM) إنتاج خلايا الجلد، ولا سيما الخلايا الليفية الجلدية والخلايا الكيراتينية البشرة. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن ECM المخصب المنتجة في إطار MMC في الثقافات أحادي الطبقة يمكن decellularized وتستخدم مصفوفة المستمدة خلية نقية (CDM).
نحن نستخدم نهجا غير تقليدي لتصور ونقدر تماما ECM المودعة من قبل خلايا الجلد مثقف مع MMC. يستخدم التدخل انعكاس المجهري عادة لدراسة التفاعلات خلية مصفوفة أو نقاط الاتصال الخلية الى الزجاج. وقد استخدمت هذه التقنية في نظامنا لعرض المبلغ الإجمالي للمصفوفة تترسب على سطح الزجاج. وقد يقترن تدخل انعكاس المجهر مع المناعية الفلورية للحصول على اكبر قدر من المعلومات من حيث التكوين المصفوفة خارج الخلية ونمط، في حضور وغياب MMC.
Organotypiج الجلد المشترك الثقافات هو الطريقة الكلاسيكية لنموذج الجلد في المختبر في إطار ثلاثي الأبعاد. في حين ثنائية الأبعاد المشترك الثقافات قد يوفر معلومات مهمة، فمن محدود عند ترجمة هذه البيانات وتطبيقه مرة أخرى إلى البيئة في الجسم الحي، والتي هي بطبيعتها هيكل ثلاثي الأبعاد. الكيراتينية الجلد، وعلى وجه الخصوص، الاستقطاب وتحتوي على شرائح قمي والقاعدية التي تعتبر أساسية لتوازن والالتزام الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن البروتينات suprabasal نموذجية في الخلايا الكيراتينية فوق الطبقة القاعدية، مثل الكيراتين 1، الكيراتين 10 و filaggrin موجود فقط في سياق التقسيم الطبقي والتمايز النهائي من الخلايا الكيراتينية. كما التمايز النهائي لا يكاد يكون موجودا في الثقافات أحادي الطبقة العادية، وعادة لا يتحقق تعبير البروتين suprabasal في هذا النظام الثقافة. لذلك، تبدأ الثقافات عضوي النمط المغمورة في مستنبت، ولكن بعد ذلك ورفعت إلى واجهة الهواء السائل لدفع keratinocytالبريد التمايز. ويؤدي ذلك إلى التعبير عن علامات الطبقية، حتى التقرن وانعكاس أفضل بشكل عام من علم وظائف الأعضاء البشرة. بينما مجموعات أخرى قد ولدت من قبل عضوي النمط الجلد المشترك الثقافات بنجاح، فإن إنشاء منطقة الوصل البشروي الأدمي وظيفية قضية. هنا، نقدم طريقة جديدة لزراعة عضوي النمط الجلد المشترك الثقافات مع الغشاء القاعدي المعززة، في إطار زمني مكثف ودون المساس استحقاق هذه التركيبات. وهذا من شأنه توفير محاكيات الجلد لفي المختبر النمذجة، ودراسة علم الأحياء الجلد ومجموعة متنوعة من فحوصات الفرز.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering–a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
