Verbetering van 2D- en 3D-Skin<em> In Vitro</em> Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding
Summary
We presenteren een protocol om cellen afgeleide matrices rijk aan extracellulaire matrix eiwitten te verkrijgen, met behulp van macromoleculaire Crowders (MMC). Bovendien presenteren we een protocol dat MMC in 3D organotypische co-kweek huid generatie, die kweektijd vermindert behoud looptijd construct omvat.
Abstract
Het glycoproteïne familie van collageen vormt de belangrijkste structurele eiwitten in het menselijk lichaam en zijn belangrijke componenten van biomaterialen gebruikt in de moderne tissue engineering. Een technische knelpunt de afzetting van collageen in vitro, aangezien het berucht traag, resulterend in suboptimale vorming van bindweefsel en daaropvolgende weefsel samenhang name huidmodellen. Hier beschrijven we een werkwijze die de toevoeging van verschillend formaat sucrose copolymeren huid kweken omvat macromoleculaire crowding (MMC), wat resulteert in een dramatische verbetering van collageenafzetting genereren. Bijzonder dermale fibroblasten afgezet een aanzienlijke hoeveelheid collageen I / IV / VII en fibronectine onder MMC in vergelijking met controles.
Het protocol beschrijft ook een werkwijze te druk cellagen decellularize aanzienlijke hoeveelheden extracellulaire matrix (ECM) die werden vastgehouden op het kweekoppervlak bloot blijkens immunocytochemistry. Total matrix massa en distributie patroon werd bestudeerd met behulp van interferentie reflectie microscopie. Interessant, fibroblasten, keratinocyten en co-kweken geproduceerde cellen afgeleide matrices (CDM) variërende samenstelling en morfologie. CDM kunnen worden gebruikt als "bio-scaffolds" voor secundaire cel enten, waarbij het huidige gebruik van coatings of steigers, meestal van xenogene dierlijke bronnen, kunnen worden vermeden, waardoor een bijsturing naar klinisch relevante toepassingen.
Daarnaast heeft dit protocol beschrijft de toepassing van MMC in de ondergedompelde fase van een 3D-organotypische skin co-kweekmodel dat voldoende ECM afzetting te verbeteren in de dermo-epidermale junctie (DEV), in het bijzonder was, collageen VII, de hoofdcomponent van ankerfibrillen. Elektronenmicroscopie bevestigde de aanwezigheid van ankerfibrillen in kweken ontwikkeld met MMC, in vergelijking met controles. Dit is belangrijk omdat ankerfibrillen tether de dermis op de epidermis, dusmet een voorgevormde mature DEJ kunnen profiteren huidtransplantatie ontvangers in termen van graft stabiliteit en de algemene wondgenezing. Bovendien werd cultuur tijd gecondenseerd uit 5 weken tot 3 weken de tijd om een volwassen construct te verkrijgen bij het gebruik van MMC, de kosten te verlagen.
Introduction
De huid vormt een beschermende barrière door te voorkomen dat water verlies en ziekteverwekker binnenkomst. Het bestaat uit drie hoofdbestanddelen; de stromale rijke dermis 1, een gelaagde epidermis 2,3,4 op de top van het, en de dermo-epidermale verbinding in tussen 5,6. De dermis bestaat grotendeels uit collageen en elastische vezels en is dun bevolkt met fibroblasten 7. Daarentegen wordt de cellenrijke epidermis bestaat uit meervoudige lagen van keratinocyten. De keratinocyten van de diepste laag zijn proliferatieve en nieuwe basale cellen die vernieuwen en vervangen terminaal differentiërende keratinocyten die constant naar de buitenste laag van de huid en hun kernen en cytoplasmatische materiaal verloren, waardoor een verhoornde laag die uitgebreid schilfering.
De dermale-epidermale junctie, een specifiek type basaalmembraan is een complexe structuur bestaande uit onderling verbonden matrix moleculen, die tethers de epidermis aan de dermis. Collageen I vezels van de lederhuid vervlochten met collageen VII ankerfibrillen die zijn verankerd aan het collageen IV rijke lamina densa. Verankering filamenten (laminine 5, collageen XVII en integrines) op zijn beurt sluit de lamina densa met hemidesmosomen van basale keratinocyten. Basale keratinocyten (Kiemlaag) hebben het vermogen om te prolifereren en te vernieuwen, en differentiëren en stratificeren de suprabasale lagen vormen; stratum spinosum, stratum granulosum, en tenslotte het stratum corneum, waarbij het contactoppervlak van de huid vormt met de omgeving. Op weg van de basale laag op de verhoornde laag keratinocyten overschakelen expressiepatronen van cytokeratines en uiteindelijk apoptose en omsluiten zich in verhoornde enveloppen, rompen van specifieke eiwitten die covalent verknoopt met transglutaminase activiteit.
Recreëren huid en de lagen in vitro, zoals de complexe structuren van de dermale-epidermale junctie en dermale extracellulaire matrix, en de verhoorningsproces proces na te bootsen, is al lang geïntrigeerd wetenschappers en bioengineers als een uitdagende taak. Er zijn aanzienlijke vooruitgang in huidweefsel techniek, bijvoorbeeld is de succesvolle extractie van huidcellen van patiënt biopsies en het genereren van huid organotypische kweken behulp patiënt afgeleide huidcellen 8. Echter, onopgeloste problemen blijven met betrekking tot slechte secretie van extracellulaire matrix eiwitten door de huidcellen zelf en resulteert in suboptimale huid modellen. Bovendien is de tijd die nodig is om 3D organotypische huid co-kweek met gebruikmaking van bestaande protocollen genereren varieert van vier tot acht weken, een tijdsbestek dat zou kunnen worden ingekort met de opname van macromoleculaire Crowders. Vermindering kweekduur bespaart reagenskosten, vermindert de incidentie van celsenescentie en vermindert de wachttijd van de patiënt moet het product worden gebruikt in de kliniek.
t "> macromoleculaire crowding (MMC) omvat houdende specifieke macromoleculen aan het kweekmedium uitgesloten volume-effecten. Deze hebben invloed enzymatische reactiesnelheden waaronder proteolytische splitsing van procollageen die traag onder standaard kweekomstandigheden waterige 9-13. Onder MMC, enzymatische reacties genereren worden bespoedigd zonder verhoging van de hoeveelheid reagentia 14,15 waardoor, bij procollageen splitsing, een verhoogde hoeveelheid collageen I-moleculen in drukke kweken vergeleken met de controles 10 rustig. als de omzetting van procollageen collageen maakt de vorming van collageen samenstellingen, fibroblasten gekweekt met MMC gedurende 48 uur leverde aanzienlijk meer collageen I in vergelijking met rustig fibroblast kweken gecontroleerd tot vier weken 11,16,17. Naast effecten op enzymatische activiteiten die de vorming, stabilisatie en hermodellering van ECM beïnvloeden, ook MMC aangetoond is rechtstreeks versterken en moduleren collageenvezelvorming 18,19.We stellen hier een werkwijze voor de productie extracellulaire matrix (ECM) van huidcellen, met name dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten verbeteren. Bovendien tonen wij dat de verrijkte ECM geproduceerd onder MMC in monolaag culturen worden ontceld en gebruikt als zuivere cel-afgeleide matrix (CDM).
We maken gebruik van een niet-conventionele benadering te visualiseren en de ECM afgezet door huidcellen gekweekt met MMC ten volle benutten. Interferentie reflectie microscopie wordt meestal gebruikt voor het bestuderen van cel-matrix interacties en cel-glas contactpunten. Deze techniek werd gebruikt in ons systeem de totale matrix afgezet op het glasoppervlak bekijken. Interferentie reflectie microscopie gekoppeld met fluorescerende immunokleuring om de hoeveelheid informatie te verkrijgen in termen van extracellulaire matrix samenstelling en patroon, in aanwezigheid en afwezigheid van MMC.
Organotypic skin co-culturen is een klassieke methode voor het huidmodel in vitro in een driedimensionale context. Terwijl twee-dimensionale co-culturen belangrijke informatie kan verschaffen, is beperkt bij het vertalen van deze informatie bevat welke naar een in vivo omgeving, die inherent een driedimensionale structuur. Huidkeratinocyten name zijn gepolariseerd en apicale en basale segmenten die essentieel is voor homeostase en celadhesie bevatten. Daarnaast is de expressie van eiwitten in typische suprabasale keratinocyten boven de basale laag, zoals keratine 1, keratine 10 en filaggrin is alleen aanwezig in de loop van stratificatie en differentiatie van keratinocyten. Zoals terminale differentiatie nauwelijks aanwezig in de typische monolaag culturen is, wordt suprabasale eiwitexpressie gewoonlijk niet gehaald in deze cultuur systeem. Daarom start organotypische culturen ondergedompeld in kweekmedium, maar worden dan opgeheven om een lucht-vloeistof interface naar keratinocyt rijdene differentiatie. Dit resulteert in de expressie van stratificatie markers, zelfs verhoorning en een algemeen beter weer epidermale fysiologie. Terwijl andere groepen die eerder met succes hebben gegenereerd organotypische huid co-culturen, heeft de invoering van een functionele dermo-epidermale verbinding zone een probleem geweest. Hier presenteren we een nieuwe methode voor het kweken van huid organotypische co-culturen met een verbeterd basaal membraan, in een verkorte termijn en zonder afbreuk te doen aan de looptijd van deze constructen. Dit zou skin mimetica in vitro modellen, de studie van de huid biologie en een assortiment van screeningstesten verschaffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering–a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
