Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em> In Vitro</em> Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding
Summary
Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.
Abstract
Das Glycoprotein-Familie von Kollagenen stellt die Hauptstrukturproteine in den menschlichen Körper, und sind wichtige Komponenten von Biomaterialien in modernen Tissue Engineering eingesetzt. Ein technischer Engpass ist die Ablagerung von Kollagen in vitro, da sie bekanntermaßen langsam ist, in suboptimalen Bildung von Bindegewebe und anschließende Gewebekohäsions resultierende, insbesondere in Hautmodellen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das die Zugabe von differentiell-sized Saccharose Co-Polymere Hautkulturen umfasst makromolekulare Verdrängung (MMC) zu erzeugen, die in einer dramatischen Erhöhung der Kollagenablagerung führt. Insbesondere abgeschieden dermalen Fibroblasten eine erhebliche Menge an Kollagen I / IV / VII und Fibronektin unter MMC im Vergleich zu Kontrollen.
Das Protokoll beschreibt auch ein Verfahren gedrängten Zellschichten zu Dezellularisieren, beträchtliche Mengen an extrazellulären Matrix (ECM) Belichten der auf der Kulturfläche zurückgehalten wurden, wie durch immunocy bewiesentochemistry. Gesamtmatrixmasse und Verteilungsmuster wurde unter Verwendung von Interferenz-Reflexions-Mikroskopie untersucht. Interessanter, Fibroblasten, Keratinozyten und Co-Kulturen hergestellt Zellen abgeleiteten Matrizen (CDM) der Zusammensetzung und der Morphologie verändern. CDM könnte als "bio-Scaffolds" für die sekundäre Zellaussaat, wo die aktuelle Verwendung von Beschichtungen oder Gerüste, typischerweise von xenogenen tierischen Quellen verwendet werden, vermieden werden können, damit zur weitere klinisch relevante Anwendungen bewegen.
Zusätzlich beschreibt dieses Protokoll die Anwendung von MMC während der Tauchphase eines 3D-organotypischen Haut Kokultur-Modell, das ausreichend war ECM Ablagerung in der dermo-epidermalen Verbindung (DEJ), insbesondere, Kollagen VII, der Hauptbestandteil zu verbessern von Ankerfibrillen. Die Elektronenmikroskopie bestätigte die Anwesenheit von mit MMC entwickelten Fibrillen in Kulturen Verankerung, im Vergleich zu Kontrollen. Dies ist bedeutsam, als Verankerungs Fibrillen der Dermis auf die Epidermis anbinden, damitmit einem vorgeformten reifen DEJ Hauttransplantation Empfänger in Bezug auf die Graft-Stabilität und die gesamte Wundheilung profitieren können. Des Weiteren wurde Kulturzeit von 5 Wochen bis 3 Wochen kondensiert ein reifes Konstrukt zu erhalten, wenn MMC verwenden, die Kosten zu senken.
Introduction
Die Haut bildet eine schützende Barriere, die durch Wasserverlust und Krankheitserreger Eintritt zu verhindern. Es besteht aus drei Hauptkomponenten; die Stroma reichen Dermis 1, eine geschichtete Epidermis 2,3,4 oben drauf, und der dermo-epidermalen Verbindung zwischen 5,6. Die Dermis besteht hauptsächlich aus kollagenen und elastischen Fasern zusammengesetzt und ist dünn besiedelt mit Fibroblasten 7. Im Gegensatz dazu wird die zellreiche Epidermis aus mehreren Schichten von Keratinozyten zusammen. Die Keratinozyten der innerste Schicht sind proliferative und neue basalen Zellen bereitzustellen, die unheilbar erneuern und ersetzen Keratinozyten, die sich ständig bewegen, um die äußerste Schicht der Haut und haben verloren ihre Kerne und Zytoplasma-Material, was zu einer verhornte Schicht Differenzierung, die erfährt Schuppung.
Die dermale-epidermale Verbindung, eine bestimmte Art von Basalmembran, ist eine komplexe Struktur aus miteinander verbundenen Matrixmolekülen zusammengesetzt, die tethers die Epidermis in die Dermis. Collagen-I-Fasern der Dermis Interlace mit Kollagen VII Fibrillen Verankerung, die an das Kollagen IV reichen Lamina densa verankert sind. Verankerungs Filamente (Laminin 5, Kollagen XVII und Integrine) wiederum verbinden die Lamina densa mit Hemidesmosome basaler Keratinozyten. Basalen Keratinozyten (Stratum basale) haben die Fähigkeit, sich zu vermehren und zu erneuern, sowie differentiate und stratify die suprabasalen Schichten zu bilden; stratum spinosum, stratum granulosum, und schließlich das Stratum corneum, die mit der Umgebung der Kontaktfläche der Haut dar. Auf dem Weg von der Basalschicht an die Hornschicht der Schalter Keratinozyten Expressionsmuster von Zytokeratine und schließlich Apoptose und umhüllen sich in verhornten Umschläge Rümpfe der spezifischen Proteine, die durch Transglutaminase-Aktivität kovalent vernetzt sind.
Recreating Haut und deren Schichten in vitro, einschließlich der komplexen Strukturen des dermalen-epidermalen Verbindung und dermalen extrazellulären Matrix und die Verhornungsprozess zu emulieren, hat lange faszinierte Wissenschaftler und bioengineers als anspruchsvolle Aufgabe. Es wurden bedeutende Fortschritte in Hautgewebe – Engineering, beispielsweise die erfolgreiche Extraktion von Hautzellen von Patienten Biopsien und die Erzeugung von Haut organotypischen Kulturen unter Verwendung von Patienten stammenden Hautzellen 8. Jedoch bleiben ungelöste Probleme in Bezug auf schlechte Sekretion von extrazellulären Matrixproteinen von den Hautzellen selbst und was zu suboptimalen Hautmodelle. Weiterhin wird die Zeit variiert zwischen vier bis acht Wochen 3D organotypischen Haut Kokultur mit den aktuellen Protokolle zu erzeugen, einen Zeitrahmen, die potentiell mit dem Einbau von hochmolekularen Crowders verkürzt werden konnte. Reduktionskultivierungszeit spart Reagenzkosten, verringert die Häufigkeit von Zellalterung und reduziert die Wartezeit des Patienten sollte in der Klinik das Produkt verwendet werden.
t "> makromolekulare Verdrängung (MMC) mit spezifischen Makromolekülen in das Kulturmedium einzuführen ausgeschlossen Volumeneffekte zu erzeugen. Diese beeinflussen die enzymatische Reaktionsraten einschließlich der proteolytischen Spaltung von Prokollagen , die 9-13 säumig unter wässrigen Standardkulturbedingungen ist. Unter MMC, enzymatische Reaktionen 14,15 was im Falle von Prokollagen Spaltung, eine erhöhte Menge an Kollagen I Moleküle in gedrängten Kulturen im Vergleich zu Kontrollen laufenen 10. da die Umwandlung von Prokollagen zu Kollagen beschleunigt , ohne die Menge der Reagenzien Erhöhung ermöglicht die Bildung von Kollagen Baugruppen, mit MMC kultivierten Fibroblasten 48 Stunden ergab signifikant mehr Kollagen I im Vergleich zu laufenen Fibroblastenkulturen für bis zu vier Wochen überwacht 11,16,17. Neben Auswirkungen auf enzymatische Aktivitäten, die die Bildung, Stabilisierung und Remodellierung von ECM, MMC auch beeinflussen wurde Kollagen gezeigt, direkt verbessern und zu modulierenFaserbildung 18,19.Wir stellen Ihnen hier eine Methode, um die extrazelluläre Matrix (ECM) Produktion von Hautzellen zu verbessern, insbesondere dermale Fibroblasten und Keratinozyten. Darüber hinaus zeigen wir, dass die angereicherte ECM unter MMC in Monolayer-Kulturen erzeugt werden, können als reine Zellen abgeleiteten Matrix (CDM) dezellularisiert und verwendet werden.
Wir verwenden eine nicht-konventionellen Ansatz zu visualisieren und in vollem Umfang schätzen die von Hautzellen kultiviert abgelagert ECM mit MMC. Interferenzreflexionsmikroskopie zur Untersuchung von Zell-Matrix-Interaktionen oder Zell-zu-Glas-Kontaktstellen der Regel verwendet. Diese Technik wurde in unserem System verwendet, um die Gesamtmenge der Matrix, auf der Glasoberfläche abgeschieden anzuzeigen. Interferenz-Reflexionsmikroskopie wurde gekoppelt mit Fluoreszenzimmunfärbungs die meisten Informationsmenge in Bezug auf die extrazelluläre Matrixzusammensetzung und das Muster, in Gegenwart und Abwesenheit von MMC zu erhalten.
Organotypic Haut Kokulturen ist eine klassische Methode , um die Haut in vitro in einem dreidimensionalen Kontext zu modellieren. Während zweidimensionale Kokulturen signifikante Information liefern kann, ist sie begrenzt , wenn diese Daten zu übersetzen und es zurück zu einer in vivo – Umgebung der Anwendung, die von Natur aus eine dreidimensionale Struktur. Haut-Keratinozyten, insbesondere sind polarisiert und enthalten apikalen und basalen Segmente, die für die Homöostase und Zelladhärenz wesentlich sind. Zusätzlich ist die Expression von typischen suprabasalen Proteine in Keratinozyten über der basalen Schicht, wie Keratin 1, Keratin 10 und Filaggrin nur im Zuge der Schichtung und terminale Differenzierung von Keratinozyten. Da die terminale Differenzierung kaum in typischen Monolayer-Kulturen ist, wird suprabasal Proteinexpression normalerweise nicht in diesem Kultursystem erreicht. Daher beginnen organotypischen Kulturen in Kulturmedium eingetaucht, aber werden dann einer Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle angehoben zu fahren keratinocyte Differenzierung. Dies resultiert in der Expression von Markern Schichtung sogar Verhornung und eine allgemein bessere Reflexion der epidermalen Physiologie. Während andere Gruppen zuvor organotypischen Haut Co-Kulturen erfolgreich generiert haben, hat sich die Einrichtung eines funktionalen dermoepidermale Verbindungszone ein Thema. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur Kultivierung von organotypischen Haut Co-Kulturen mit einer verbesserten Basalmembran, in einer verkürzten Zeitrahmen und ohne die Reife dieser Konstrukte zu beeinträchtigen. Dies würde Haut Mimetika für in – vitro – Modellierung bereitzustellen, die Untersuchung der Hautbiologie und ein Sortiment von Screening – Assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
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