Migliorare 2D e 3D della pelle<em> In Vitro</em> modelli con Macromolecole affollamento
Summary
Vi presentiamo un protocollo per ottenere matrici derivati dalle cellule ricche di proteine della matrice extracellulare, utilizzando Crowders macromolecolari (MMC). Inoltre, vi presentiamo un protocollo che incorpora MMC nella generazione di pelle co-coltura organotipica 3D, che riduce i tempi di cultura, pur mantenendo la maturità di costrutto.
Abstract
La famiglia glicoproteina di collagene rappresenta i principali proteine strutturali del corpo umano, e sono componenti chiave di biomateriali utilizzati in ingegneria dei tessuti moderni. Una strozzatura tecnica è la deposizione di collagene in vitro, come è notoriamente lento, causando formazione sub-ottimale del tessuto connettivo e successiva coesione dei tessuti, soprattutto nei modelli della pelle. Qui, si descrive un metodo che prevede l'aggiunta di copolimeri saccarosio differenzialmente dimensioni per culture pelle per generare macromolecolari affollamento (MMC), che si traduce in un miglioramento drammatico della deposizione di collagene. In particolare, fibroblasti dermici depositato una notevole quantità di collagene I / IV / VII e fibronectina in MMC rispetto ai controlli.
Il protocollo descrive anche un metodo per decellularize strati cellulari affollate, esponendo quantità significative di matrice extracellulare (ECM) che sono stati trattenuti sulla superficie cultura come evidenziato da immunocytochemistry. modello di massa e la distribuzione di matrice totale è stata studiata usando la microscopia interferenze riflessione. È interessante notare che le matrici, i fibroblasti, cheratinociti e co-culture producevano derivati dalle cellule (CDM) di varia composizione e morfologia. CDM potrebbe essere utilizzato come "bio-scaffold" per la semina cella secondaria, dove l'attuale uso di rivestimenti o ponteggi, in genere da fonti animali xenogeniche, può essere evitato, così spostando verso applicazioni più clinicamente rilevante.
Inoltre, questo protocollo descrive l'applicazione della MMC durante la fase di immersione di un modello 3D-organotipica pelle co-coltura che era sufficiente per migliorare la deposizione di ECM nella giunzione dermo-epidermica (GDE), in particolare, collagene VII, il componente principale di ancoraggio fibrille. La microscopia elettronica ha confermato la presenza di ancoraggio fibrille in culture sviluppate con MMC, rispetto ai controlli. Ciò è significativo come fibrille di ancoraggio Tether il derma all'epidermide, di conseguenza,avere un preformato maturo DEJ può beneficiare destinatari trapianto di pelle in termini di stabilità del trapianto e la guarigione delle ferite nel complesso. Inoltre, il tempo di coltura è stato condensato da 5 settimane a 3 settimane per ottenere un costrutto matura, quando si utilizza MMC, riducendo i costi.
Introduction
La pelle forma una barriera protettiva prevenendo la perdita di acqua e l'ingresso del patogeno. Esso è costituito da tre componenti principali; derma ricchi stromali 1, un stratificati epidermide 2,3,4 su di esso, e la giunzione dermo-epidermica tra 5,6. Il derma è composto in gran parte da fibre collagene ed elastiche ed è scarsamente popolate con fibroblasti 7. Al contrario, l'epidermide ricco di cellule è composto da più strati di cheratinociti. I cheratinociti dello strato più interno sono proliferative e forniscono nuove cellule basali che rinnovano e sostituiscono cheratinociti terminali di differenziazione che si muovono continuamente al più esterno strato di pelle e hanno perso i nuclei e materiale citoplasmatico, causando uno strato corneo che subisce desquamazione.
La giunzione dermo-epidermica, un tipo specifico di membrana basale, è una struttura complessa composta comunicanti molecole della matrice, che tetheRS l'epidermide al derma. Collagene I fibre del derma si intrecciano con il collagene VII ancoraggio fibrille che sono ancorati al collagene IV ricco lamina densa. filamenti di ancoraggio (laminina 5, collagene XVII e integrine) a loro volta collegano la densa lamina con emidesmosomi di cheratinociti basali. cheratinociti basali (strato germinativo) hanno la capacità di proliferare e rinnovare, nonché differenziare e stratificare per formare gli strati soprabasali; strato spinoso, strato granuloso, ed infine lo strato corneo, che rappresenta la superficie di contatto della pelle con l'ambiente. tragitto dallo strato basale allo strato corneo, cheratinociti passare pattern di espressione di citocheratine e infine apoptosi e si racchiudono in cornified buste, gusci di proteine specifiche che sono covalente reticolati dall'attività transglutaminasi.
Ricreare pelle ed i suoi strati in vitro, incluse le complesse strutture della giunzione dermo-epidermica e della matrice extracellulare dermica, e di emulare il processo di cheratinizzazione, ha gli scienziati lungo incuriosito e bioingegneri come un compito impegnativo. Ci sono stati progressi significativi in ingegneria dei tessuti della pelle, per esempio, l'estrazione di successo di cellule della pelle da biopsie di pazienti e la generazione di colture organotipiche pelle utilizzando le cellule della pelle di pazienti di derivazione 8. Tuttavia, rimangono problemi irrisolti relativi alla scarsa secrezione di proteine della matrice extracellulare dalle cellule stesse e conseguente modelli di cute sub-ottimali. Inoltre, il tempo necessario per generare co-coltura organotipica pelle 3D utilizzando i protocolli attuali varia tra i quattro a otto settimane, un lasso di tempo che potrebbe potenzialmente essere ridotto con l'incorporazione di Crowders macromolecolari. Ridurre il tempo cultura risparmiare costi reagente, riduce l'incidenza di senescenza cellulare e riduce il tempo di attesa del paziente deve utilizzare il prodotto in clinica.
t "> macromolecolare affollamento (MMC) comporta l'introduzione di macromolecole specifiche al mezzo di coltura per generare effetti di volume esclusi. Questi colpiscono velocità di reazione enzimatici tra cui il taglio proteolitico di procollagene che è tardiva in condizioni di coltura acquose standard di 9-13. Sotto MMC, reazioni enzimatiche sono accelerato senza aumentare la quantità di reagenti 14,15 conseguente, nel caso di procollagene clivaggio, una maggiore quantità di collagene I molecole in culture affollate rispetto ai controlli affollate 10. come la conversione di procollagene al collagene permette la formazione del collagene assemblee, colture di fibroblasti con MMC per 48 ore ha prodotto significativamente più collagene I rispetto a colture di fibroblasti affollate monitorati fino a quattro settimane 11,16,17. Oltre effetti sulle attività enzimatiche che riguardano la formazione, la stabilizzazione e il rimodellamento della ECM, MMC anche ha dimostrato di migliorare direttamente e modulare collagenela formazione di fibra 18,19.Presentiamo qui un metodo per aumentare la produzione di matrice extracellulare (ECM) da parte delle cellule della pelle, in particolare, fibroblasti dermici e cheratinociti epidermici. Inoltre, dimostriamo che l'ECM arricchito prodotto in MMC in colture monostrato può essere decellularized e usato come matrice di puro derivato dalle cellule (CDM).
Usiamo un approccio non convenzionale di visualizzare e pienamente apprezzare l'ECM depositato da cellule della pelle in coltura con MMC. Interferenza riflessione microscopia è in genere utilizzato per lo studio delle interazioni cellula-matrice o cellula-vetro punti di contatto. Questa tecnica è stata utilizzata nel nostro sistema per visualizzare la quantità totale di matrice depositato sulla superficie del vetro. Interferenza riflessione microscopia è stata accoppiata con immunocolorazione fluorescente avere la maggior quantità di informazioni in termini di composizione della matrice extracellulare e modello, in presenza e assenza di MMC.
Organotypic pelle co-culture è un metodo classico per modellare la pelle in vitro in un contesto tridimensionale. Mentre bidimensionali co-culture possono fornire informazioni significative, è limitato quando traduce questi dati e l'applicazione di nuovo a un ambiente in vivo, che è intrinsecamente una struttura tridimensionale. cheratinociti della pelle, in particolare, sono polarizzati e contengono segmenti apicali e basali che sono essenziali per l'omeostasi e l'adesione cellulare. Inoltre, l'espressione di proteine tipiche soprabasali nei cheratinociti sopra strato basale, come la cheratina 1, cheratina 10 e filaggrina è presente solo nel corso di stratificazione e differenziazione terminale dei cheratinociti. Come differenziazione terminale è poco presente nelle culture tipiche monostrato, espressione della proteina soprabasale è normalmente non raggiunto in questo sistema di coltura. Pertanto, colture organotipiche iniziano immersi in terreno di coltura, ma vengono poi sollevati ad una interfaccia aria-liquido per guidare keratinocyte differenziazione. Ciò si traduce in l'espressione di marcatori di stratificazione, anche cheratinizzazione e un generalmente migliore riflessione della epidermica fisiologia. Mentre altri gruppi hanno generato in precedenza co-colture di pelle organotipica con successo, la creazione di una zona di giunzione dermo-epidermica funzionale è stato un problema. Qui, vi presentiamo un nuovo metodo per la coltura co-colture di pelle organotipica con una membrana basale maggiore, in un lasso di tempo condensato e senza compromettere la maturità di questi costrutti. Ciò fornirebbe mimetici della pelle per la modellazione in vitro, lo studio della biologia della pelle e un assortimento di test di screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
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