2Dと3Dの肌の改善<em>インビトロ</em分子クラウディングの使用>モデル
Summary
我々は、高分子crowders（MMC）を使用して、細胞外マトリックスタンパク質に富む細胞由来のマトリックスを得るためのプロトコルを提示します。また、我々は、コンストラクトの成熟度を維持しながら、培養時間を減少させる3D器官型皮膚共培養世代でMMCを組み込むプロトコルを提示します。
Abstract
コラーゲンの糖タンパク質ファミリーは、ヒトの体内での主な構造タンパク質を示しており、近代的な組織工学で使用される生体材料の主要コンポーネントです。それは、特に皮膚モデルにおいて、結合組織およびその後の組織の凝集の次善の形成をもたらす、悪名高い遅いような技術ボトルネックは、in vitroでのコラーゲンの沈着です。ここでは、コラーゲン沈着の劇的な向上をもたらす分子クラウディング（MMC）を生成するために、皮膚培養物に差次サイズスクロース共重合体を添加することを含む方法を記載します。特に、皮膚線維芽細胞は、対照と比較して、MMCの下のI / IV / VIIおよびフィブロネクチン、コラーゲンを大量に堆積しました。
プロトコルはまたimmunocyによって証明されるように培養表面上に保持された細胞外マトリックス（ECM）の著しい量を露光、混雑した細胞層を脱細胞化する方法を記載します組織化学。トータルマトリックス質量および分布パターンは、干渉反射顕微鏡を用いて調べました。興味深いことに、線維芽細胞、ケラチノサイトおよび共培養は、様々な組成や形態の細胞由来のマトリックス（CDM）を生産しました。 CDMは、より臨床的に関連するアプリケーションに向けて移動させる、コーティングまたは足場の現在の使用は、典型的には、異種動物源から、回避することができる二次電池の播種用「バイオ足場」として使用することができます。
また、このプロトコルは、特に、真皮 – 表皮接合部（DEJ）にECMの沈着を増強するのに十分であった3次元器官型皮膚共培養モデル、コラーゲンVII、主成分の浸漬段階中にMMCの適用を記載しますフィブリルを固定します。電子顕微鏡は、対照と比較して、MMCを使用して開発の文化にフィブリルを固定するの存在を確認しました。アンカーフィブリル従って、表皮と真皮をつなぐので、これは重要です予め形成された成熟DEJは、移植片の安定性と全体的な創傷治癒の点で皮膚移植片レシピエントの利益を得ることができる持ちます。また、培養時間は、コストを削減、MMCを使用する場合に、成熟した構築物を得るために、3週間、5週間から濃縮しました。
Introduction
皮膚は、水の損失及び病原体侵入を防止することにより、保護バリアを形成します。これは、3つの主要コンポーネントで構成されています。間質豊富な真皮1、その上に層状表皮2,3,4、および5,6間における真皮表皮接合部。真皮は主にコラーゲンと弾性繊維で構成されており、まばら線維芽細胞7が入力されます。対照的に、細胞が豊富な表皮ケラチノサイトの複数の層で構成されています。最も内側の層のケラチノサイトは、増殖され、更新し、常に皮膚の最も外側の層に移動して受ける角質層で、その結果、それらの核と細胞質材料を失った末端分化するケラチノサイトを置き換える新たな基底細胞を提供します落屑。
真皮 – 表皮接合部、基底膜の特定のタイプは、tethe相互接続マトリックス分子からなる複合構造体であります真皮に表皮をRS。真皮のコラーゲンI繊維は、コラーゲンIV豊富な緻密層に固定されているコラーゲンVIIアンカリングフィブリルと交錯します。順番にアンカリングフィラメント（ラミニン5、コラーゲンXVIIおよびインテグリン）は、基底ケラチノサイトのヘミデスモゾームに緻密層を接続します。基底ケラチノサイト（基底層）が分化し、基底上層を形成するために階層化だけでなく、増殖して更新する能力を持っています。有棘層、顆粒層、および環境と肌の接触面を示し、最終的に角質層、。角質層の基底層からエンルート 、ケラチノサイトは、サイトケラチンの発現パターンを切り替えて、最終的にアポトーシスを受けるし、角質化で自分自身を包みます封筒、共有結合トランスグルタミナーゼ活性によって架橋されている特定のタンパク質の殻。
の複雑な構造を含む、in vitroで皮膚とその層の再作成真皮 – 表皮接合部および真皮細胞外マトリックス、および角化プロセスをエミュレートするには、やりがいのある仕事であれば、興味をそそら科学者や生体工学を持っています。例えば、患者の生検から皮膚細胞の正常な抽出および患者由来の皮膚細胞8を用いて皮膚の器官培養物の生成皮膚組織工学における重要な進歩がありました。しかし、未解決の問題は、皮膚細胞自体による細胞外マトリックスタンパク質の悪い分泌に関係し、次善の皮膚モデルで得られたままです。さらに、現在のプロトコルを使用して3次元器官型皮膚共培養物を生成するのに必要な時間は、4〜8週間、潜在的に巨大分子crowdersの取り込みと短縮することができる時間枠の間で変化します。培養時間を減少させること、試薬コストを節約し、細胞老化の発生率を低減し、製品が臨床で使用されるべき患者の待ち時間を減少させます。
トン">高分子は、（MMC）混雑は排除体積効果。これらは、標準的な水性の培養条件9-13の下で遅刻であるプロコラーゲンのタンパク質分解切断を含む酵素反応速度に影響を与える。MMCの下では、酵素反応を生成するために、培養培地に特定の高分子を導入することを含みます空い対照10と比較して、混雑した培養物中のIは分子コラーゲンの量の増加、プロコラーゲン切断の場合には、その結果、試薬14,15の量を増加させることなく早めている。コラーゲンとプロコラーゲンの変換は、コラーゲンの形成を可能にするようにアセンブリ、48時間MMCを用いて培養した線維芽細胞は、最大4週間11,16,17のために監視混雑していない線維芽細胞培養物と比較して有意に多くのコラーゲンIを得た。ECMの形成、安定化およびリモデリングに影響を与える酵素活性への影響のほか、MMCも直接コラーゲンを増強し、調節することが示されています繊維形成18,19。我々はここでは特に、真皮線維芽細胞と表皮角化細胞における細胞外マトリックスの皮膚細胞による（ECM）の生産を増強する方法を提示します。また、我々は、単層培養でMMCで製造富化ECMは、脱細胞化し、純粋な細胞由来のマトリックス（CDM）として使用することができることを示しています。
私たちは、視覚化するために非従来型のアプローチを使用し、完全にMMCで培養皮膚細胞によって堆積ECMを感謝しています。干渉反射顕微鏡は、典型的には、細胞 – マトリックス相互作用または細胞 – ガラス接触点を研究するために使用されます。この技術は、ガラス表面上に堆積されたマトリックスの合計量を表示するために、我々のシステムで利用されました。干渉反射顕微鏡は、MMCの存在下および非存在下で、細胞外マトリックス組成物及びパターンの点でほとんどの情報量を得るために、蛍光免疫染色を用いてカップリングさせました。
OrganotypiC皮膚共培養は、三次元の文脈において、インビトロで皮膚をモデル化するための古典的な方法です。二次元の共培養は、重要な情報を提供することができるが、このデータを変換し、バック本質的に三次元構造であり、インビボ環境にそれを適用する場合、それは限られています。皮膚ケラチノサイトは、特に、偏光であり、恒常性と細胞接着のために必須である頂端および基底セグメントを含みます。また、このようなケラチン1、ケラチン10およびフィラグリンのように基底層以上のケラチノサイト、中の典型的な基底上のタンパク質の発現は、層化およびケラチノサイトの分化の過程で唯一の存在です。分化は、典型的な単層培養物中にほとんど存在するように、基底層直上タンパク質の発現は、通常、この培養系では達成されません。したがって、器官培養物は、培養培地中に浸漬開始、その後keratinocytを駆動するための気液界面に持ち上げられます電子分化。これは、層別マーカーの発現、さえ角化および表皮生理学の一般より良い反射が生じます。他のグループが以前に成功した器官皮膚共培養を生成しているが、機能的真皮 – 表皮接合ゾーンの確立が課題となっています。ここでは、凝縮された時間枠内で、これらの構築物の成熟度を損なうことなく、強化された基底膜と器官皮膚共培養を培養するための新しい方法を提示します。これは、in vitroでのモデリングのための皮膚模倣薬、皮膚生物学の研究およびスクリーニングアッセイの品揃えを提供するであろう。
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
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