개선 2D 및 3D 스킨<em> 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용> 모델
Summary
우리는 고분자 crowders (MMC)를 이용하여 세포 외 기질 단백질이 풍부한 세포 – 유래 매트릭스를 획득하기 위해 프로토콜을 제시한다. 또, 구조의 성숙을 유지하면서 배양 시간을 단축 차원의 Organotypic 피부 공동 배양 세대에서 MMC를 포함하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
콜라겐의 당 단백질 패밀리는 현대 조직 공학에서 사용되는 생체 물질의 주요 성분은 인체의 주요 구조 단백질을 나타내고있다. 그것은 특히 피부 모델에서, 결합 조직 및 후속 조직 응집력 차선의 형성의 결과로 악명 느린으로하는 기술 병목 시험관 안의 콜라겐 침착이다. 여기서는 콜라겐 침착의 극적인 향상을 초래 고분자 크롤 (MMC)을 생성하는 피부 배양 물을 차등 적 규모 자당 공중 합체의 첨가를 포함하는 방법을 설명한다. 특히, 피부 섬유 아세포는 컨트롤과 비교하여 MMC하에 콜라겐 I / IV / VII 및 피브로넥틴 상당한 양의 증착.
프로토콜은 또한 immunocy 의해 입증 배양 표면에 유지 된 세포 외 기질 (ECM)의 상당량이 노출 혼잡 세포층을 decellularize하는 방법을 설명tochemistry. 전체 매트릭스 질량 분포 패턴은 반사 간섭 현미경을 사용하여 연구 하였다. 구성과 형태를 변화의 흥미롭게도, 섬유 아 세포, 각질 세포와 공동 배양 생산 세포 유래 매트릭스 (CDM). CDM 따라서 더 많은 임상 적 응용 프로그램으로 이동, 코팅 또는 비계의 현재 사용은 일반적으로 이종 동물 소스에서 피할 수 이차 전지의 파종을위한 "바이오 인공 지지체"로 사용할 수 있습니다.
또한,이 프로토콜은 특히 더모 – 표피 접합부 (DEJ)에 ECM 증착을 강화하기에 충분 하였다는 3D-의 Organotypic 피부 공동 배양 모델 콜라겐 VII, 주성분의 침지 단계 MMC의 적용을 설명 의 원 섬유를 고정. 전자 현미경 대조군에 비해, MMC 개발 문화 브릴 고정구의 존재를 확인했다. 고정 원 섬유가 표피에 진피를 밧줄로이, 따라서 중요하다미리 형성된 성숙한 DEJ가 이식 안정성과 전반적인 상처 치유의 관점에서 피부 이식받는 사람을 도움이 될 필요. 또한, 배양 시간은 비용 절감, MMC를 사용하는 경우, 성숙한 구조물을 구하는 3 주 5주에서 응축시켰다.
Introduction
피부는 수분 손실과 병원균 항목을 방지하여 보호 장벽을 형성한다. 그것은 세 가지 주요 구성 요소로 구성된다; 간질 풍부한 진피 (1), 층상 표피 그 위에 2,3,4와 5,6 사이의 더모 – 표피 접합부. 진피는 주로 콜라겐과 탄성 섬유로 구성되어 있으며 드문 드문 섬유 아세포 (7)로 채워집니다. 대조적으로, 세포가 풍부한 표피 각질 세포의 여러 층으로 구성된다. 가장 안쪽 층의 각질 세포는 증식하고 갱신 끊임없이 피부의 가장 바깥 쪽 층으로 이동 겪는 각질화 층 결과들은 핵 및 세포질 물질을 잃은 말기 분화 각화 세포를 대체 새로운 기저 세포를 제공한다 박리.
진피 – 표피 접합부 기저막의 특정 유형은 tethe 도통 매트릭스 분자로 이루어지는 복합 구조진피에 표피를 RS. 진피의 콜라겐 I 섬유는 콜라겐 VII는 콜라겐 IV 풍부한 라미 densa에 고정되어 미세 섬유를 고정으로 인터레이스. 차례로 정박 필라멘트 (라미닌 5, 콜라겐 XVII 및 인테그린)를 기초 각질 세포의 hemidesmosomes와 라미 densa를 연결합니다. 기저 각질 세포 (지층 basale)는 미분과 suprabasal 층을 형성 계층화뿐만 아니라, 증식 및 갱신 능력을 가지고; 환경과 피부 접촉면을 나타내는 계층 spinosum 등, 지층 granulosum, 마지막 각질층. 각질화 층 기저층에서 욕실 경로 각질 cytokeratins의 발현 패턴을 전환하고 결국 세포 사멸을 거치며 각질화 스스로 싸는 봉투, 공유 트랜스 글 루타 미나 제 활동에 의해 가교되는 특정 단백질의 껍질.
의 복잡한 구조를 포함, 피부와 체외에서의 레이어를 재 작성 피부 – 표피 접합부 및 피부 세포 외 기질, 그리고 각화 과정을 모방하기는 어려운 작업 한 흥미 과학자와 생명 공학자가 있습니다. 예를 들어 피부 조직 공학에서 상당한 진보가 있었다, 환자의 조직 검사에서 피부 세포를 성공적으로 추출 및 환자 유래 피부 세포 (8)을 사용하여 피부의 Organotypic 문화의 생성. 그러나, 문제는 미해결 피부 세포 외 기질 단백질의 불량한 분비 자체와 관련된 차선 피부 모델의 결과를 유지. 또한, 시간은 잠재적으로 거대 crowders의 혼입으로 단축 할 수있는 기간을 현재의 프로토콜을 사용하여 3 차원의 Organotypic 피부 공존 배양을 생성하기 위해 요구되는 4 ~ 8 주 사이에서 변한다. 배양 시간을 줄이면, 시약 비용을 절감 세포 노화의 발생을 감소시키고, 환자의 대기 시간은 제품이 임상에서 사용되어야 줄인다.
t "> 거대 분자는 (MMC) 크롤 배제 부피 효과. 이러한 표준 수성 배양 조건 9-13 하에서 지각 인 프로 콜라겐의 단백질 분해 절단을 포함한 효소 반응 속도에 영향을 미친다. MMC 하에서, 효소 반응을 생성하기 위해, 배지에 특정 고분자를 도입하는 것을 포함 혼잡 제어 (10)와 비교하여 프로 콜라겐 절단 혼잡 문화 I 분자 콜라겐의 양이 증가하는 경우에, (14, 15)가 발생 시약의 양을 증가시키지 않고 재촉된다. 콜라겐 프로 콜라겐의 전환으로 콜라겐의 형성을 허용 48 시간 동안 MMC 배양 어셈블리, 섬유 아세포는 최대 4 주 11,16,17 모니터링 솟아 섬유 아세포 배양에 비해 I를 훨씬 더 많은 콜라겐을 얻었다. ECM의 형성, 안정화 및 리모델링에 영향을 미치는 효소의 활동 또한 MMC에 효과 외에도 직접적으로 개선하고 콜라겐을 조절하는 것으로 나타났다섬유화 18,19.우리는 특히 피부 섬유 아세포와 표피의 각질 형성 세포에 피부 세포에 의한 세포 외 기질 (ECM) 생산을 강화하기 위해 여기에 방법을 제시한다. 또, 단층 배양에서 생산 MMC 농축 ECM은 decellularized 순수한 세포 – 유래 매트릭스 (CDM)으로 사용될 수 있음을 보여준다.
우리는 시각화하는 비 전통적인 방법을 사용하고 완전히 MMC 배양 피부 세포에 의해 퇴적 된 ECM을 주셔서 감사합니다. 간섭 반사 현미경은 전형적으로 세포 – 매트릭스 상호 작용 또는 세포 간 유리 접점을 연구에 사용된다. 이 기술은 유리 표면 상에 증착 된 매트릭스의 총량을 확인하기 위해 시스템에서 사용 하였다. 간섭 반사 현미경 존재 및 MMC의 부재에서, 세포 외 기질 성분과 패턴의 측면에서 정보의 대부분의 양을 얻기 위해 면역 형광에 결합시켰다.
OrganotypiC 피부 공동 배양 삼차원 환경에서 시험 관내에서 피부 모델에 전형적인 방법이다. 이차원 공동 배양 중요한 정보를 제공 할 수 있지만,이 데이터를 변환하고 다시 본래 입체 구조 인 생체 내 환경에 적용 할 때 한계가있다. 피부 각질 세포, 특히, 편광하고 항상성 및 세포 부착에 필수적인 혀끝과 기저 세그먼트를 포함한다. 또, 케라틴 1 케라틴 (10)과 필라 그린 등 기저층 상기 케 라티노 사이트, 일반적인 suprabasal 단백질의 발현 및 각질 층화 말단 분화 과정에만 존재한다. 말단 분화 전형적인 단층 배양 물에서 거의 존재로서 suprabasal 단백질 발현은 보통 이러한 배양 시스템에서 달성되지 않는다. 따라서,의 Organotypic 문화는 문화 매체에 빠져들 시작,하지만 keratinocyt 구동 공기 – 액체 인터페이스에 해제된다전자 차별화. 이 층화 마커, 심지어 각화 및 표피 생리 일반적으로 더 나은 반사의 발현을 초래한다. 다른 그룹은 이전에 성공적으로 피부의 Organotypic 공동 배양을 생성하고 있지만, 기능적 더모 – 표피 접합 영역의 설정이 문제가되고있다. 여기, 우리는 압축 된 시간 내에, 향상된 기저막과의 Organotypic 피부의 공동 문화를 배양하고 이러한 구조의 성숙을 손상시키지 않고 새로운 방법을 제시한다. 이 체외 모델링을위한 피부 모방 체, 피부 생물학의 연구와 심사 분석의 구색을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
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