Улучшение 2D и 3D кожи<em> In Vitro</em> Модели Использование макромолекулярных Crowding
Summary
Мы представляем протокол для получения клеточных производных матрицы, богатые белками внеклеточного матрикса, используя высокомолекулярные crowders (MMC). Кроме того, мы приводим протокол, который включает MMC в 3D органотипического поколения кожи сокультуры, что сокращает время, сохраняя при этом культуру зрелости конструкции.
Abstract
Гликопротеина семейство коллагенов представляет основные структурные белки в организме человека, и являются ключевыми компонентами биоматериалов, используемых в современной тканевой инженерии. Технический узкое место является отложение коллагена в пробирке, как это известно , медленно, что приводит к неоптимальной образованию соединительной ткани и последующего сцепления тканей, особенно в моделях кожи. Здесь мы опишем метод, который включает в себя добавление дифференцированно размера сахарозы сополимеров в культурах кожи для создания макромолекулярных Crowding (MMC), что приводит к резкому повышению отложения коллагена. В частности, дермальные фибробласты на хранение значительное количество коллагена I / IV / VII и фибронектина при MMC, по сравнению с контрольной группой.
Протокол также описывает способ decellularize переполненном клеточных слоев, подвергая значительные количества внеклеточного матрикса (ЕСМ), которые были сохранены на поверхности культуры, о чем свидетельствует immunocytochemistry. Общая картина матрицы масс и распределение было изучено с использованием интерференции отражения микроскопии. Интересно, что фибробласты, кератиноциты и сокультурах полученные клеточные производные матрицы (МЧР) различного состава и морфологии. МЧР может быть использован как "био-строительные леса» для вторичного посева клеток, где текущее использование покрытий или строительных лесов, как правило, от ксеногенных животных источников, можно избежать, таким образом, переход к более клинически значимых приложений.
Кроме того, этот протокол описывает применение MMC при глубинном фазы 3D-Органотипической кожи модели совместного культивирования, который достаточен, чтобы усилить осаждение ЕСМ в кожно-эпидермального соединения (DEJ), в частности, коллаген VII, основным компонентом анкерных фибриллы. Электронная микроскопия подтвердила наличие анкерных фибриллы в культурах, разработанных с MMC, по сравнению с контрольной группой. Это имеет большое значение в качестве анкерных фибриллы привязывать дермы в эпидермис, следовательно,имеющий предварительно сформированный зрелый DEJ может льготники кожный трансплантат с точки зрения стабильности трансплантата и общего заживления раны. Кроме того, время культивирования конденсируют от 5 недель до 3-х недель, чтобы получить зрелую конструкцию, при использовании MMC, снижая затраты.
Introduction
Кожа образует защитный барьер, предотвращая потерю воды и поступление патогенных микроорганизмов. Она состоит из трех основных компонентов; стромальные богатые дермы 1, стратифицированной эпидермис 2,3,4 поверх него, а также кожно-эпидермального соединения между 5,6. Дерма состоит в основном из коллагена и эластичных волокон и является малонаселенной с фибробластами 7. В противоположность этому, клеточные богатые Эпидермис состоит из нескольких слоев кератиноцитов. В кератиноцитов самого внутреннего слоя являются пролиферативная и обеспечивают новые базальные клетки, которые обновляют и заменяют терминально дифференцирующие кератиноциты, которые постоянно перемещаются к наружному-самый слой кожи и потеряли их ядра и цитоплазматического материала, в результате чего в ороговевший слой, который подвергается шелушение.
Кожный-эпидермального соединения, определенный тип базальной мембраны, представляет собой сложную структуру, состоящую из взаимосвязанных молекул матрицы, которые tetheRs эпидермис в дерму. Волокна коллагена I дермы сплетаются с коллагеном VII анкерных фибриллы, которые прикреплены к коллагена IV богатых пластинкой Densa. Якорные нити (ламинин 5, коллаген XVII и интегрины), в свою очередь подключить пластинку Densa с гемидесмосома базальных кератиноцитов. Базальных кератиноцитов (базальный слой) обладают способностью к пролиферации и возобновить, а также дифференцируются и наслаиваются с образованием супрабазальном слоев; слой Spinosum, зернистого слоя, и , наконец , роговой слой, который представляет собой контактную поверхность кожи с окружающей средой. следовавшего из базального слоя рогового слоя, кератиноциты переключаться паттерны экспрессии цитокератины и , наконец , подвергаются апоптозу и упаковывают себя в роговой конверты, шелуха специфических белков, которые ковалентно поперечно-сшитыми с помощью трансглутаминазы активностью.
Воссоздание кожи и ее слоев в лабораторных условиях , в том числе сложных структур дермально-эпидермального соединения и кожная внеклеточный матрикс, и эмулировать процесс ороговения, уже давно заинтриговал ученых и биоинженеры как сложной задачей. Там были достигнуты значительные успехи в коже тканевой инженерии, например, успешное извлечение клеток кожи из биопсий пациентов и генерирование органотипических кожи культур с использованием клеток кожи пациента , полученных 8. Тем не менее, нерешенные проблемы остаются, относящиеся к плохой секреции белков внеклеточного матрикса клетками кожи себя и приводит к неоптимальной модели кожи. Кроме того, время, необходимое для создания 3D органотипической кожи совместно культуры, используя современные протоколы колеблется от четырех до восьми недель, а временные рамки, которые потенциально могут быть укороченный с включением макромолекулярных crowders. Сокращение времени культивирования снижает стоимость реагентов, снижает частоту клеточного старения и уменьшает время ожидания пациента должны продукт использоваться в клинике.
т "> Макромолекулярный скученности (MMC) , включает в себя введение специфических макромолекулы к культуральной среде для создания эффектов исключенного объема. Они влияют на ферментативные скорости реакции , включая протеолитического расщепления проколлагена , который запаздывает в стандартных условиях культивирования водных 9-13. Под ММС, ферментативные реакции которые ускорили без увеличения количества реагентов 14,15 в результате чего, в случае проколлагена расщепления, повышенное количество коллагена молекул I в перенаселенных культурах по сравнению с безлюдных управления 10. в качестве превращения проколлагена в коллаген обеспечивает образование коллагена узлы, фибробласты , культивированные с ММС в течение 48 часов получали значительно больше коллагена I по сравнению с безлюдных культур фибробластов мониторинг в течение четырех недель 11,16,17. Помимо воздействия на ферментативной активности , которые влияют на формирование, стабилизацию и ремоделирование ECM, MMC также было показано, что непосредственно усиливать и модулировать коллагенформирование волокна 18,19.Мы представляем здесь способ повышения производства внеклеточного матрикса (ЕСМ) клетками кожи, в частности, дермальные фибробласты и кератиноциты эпидермиса. Кроме того, мы покажем, что обогащенная ECM выпускается под MMC в однослойных культурах могут быть decellularized и использовать в качестве чистого клеток полученной матрицы (МЧР).
Мы используем нетрадиционный подход к визуализации и в полной мере оценить ЕСМ, осажденный клетками кожи, культивируемых с MMC. отражения интерференционной микроскопии обычно используется для изучения клетка-матрица взаимодействий или клетка-стекло точек контакта. Этот метод был использован в нашей системе, чтобы просмотреть общую сумму матрицы, нанесенной на поверхность стекла. отражение помех микроскопию в сочетании с флуоресцентным иммунным окрашиванием, чтобы получить наибольшее количество информации в терминах внеклеточной матрицы композиции и рисунка, в присутствии и в отсутствие MMC.
OrganotypiC кожи сокультурах является классическим методом для моделирования кожи в пробирке в трехмерном контексте. В то время как двумерные сокультурах может обеспечить существенную информацию, оно ограничено при переводе эти данные и применять его обратно в окружающую среду в естественных условиях, которая по своей природе является трехмерной структурой. кератиноциты кожи, в частности, являются поляризованными и содержат апикальные и базальные сегменты, которые имеют важное значение для гомеостаза и присоединения клеток. Кроме того, экспрессия типичных супрабазальных белков в кератиноцитах над базальным слоем, такие как кератин 1, кератин 10 и Filaggrin присутствует только в процессе стратификации и терминальной дифференцировки кератиноцитов. Как терминальная дифференцировка вряд ли присутствует в типичных культурах монослоя, супрабазальном экспрессии белка обычно не достигается в этой системе культуры. Поэтому органотипической культуры начинают погружена в культуральной среде, но затем поднимается до воздушно-жидкостной интерфейс к вождению keratinocytе дифференциация. Это приводит к экспрессии маркеров стратификации, даже ороговения и в целом лучше отразить эпидермального физиологии. В то время как другие группы ранее генерироваться Органотипической кожи сопутствующих культур успешно, создание функционального кожно-эпидермального соединения зоны была проблема. Здесь мы представляем новый метод культивирования Органотипической кожи сопутствующих культур с повышенной базальной мембраны, в конденсированной сроки и без ущерба для погашения этих конструкций. Это обеспечит миметики кожи для моделирования в лабораторных условиях , изучение биологии кожи и ассортимент скрининговых анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering–a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
