Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em> İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma> Modeller
Summary
Bu makromoleküler Crowders (MMC) kullanarak, hücre dışı matris protein açısından zengin hücre-türevi matrisleri elde etmek için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, yapının vadesinin korurken kültür süresini azaltır 3D Organotipik bir deri ko-kültür üretimi bölgesi MMC içeren bir protokol mevcut.
Abstract
kolajenlerin glikoprotein ailesi, modern doku mühendisliğinde kullanılan biyomateryallerin anahtar bileşenleri insan vücudunda ana yapısal proteinleri temsil eder ve vardır. Bu özellikle deri modellerinde, bağ dokusu ve daha sonra doku uyum optimal oluşumu ile sonuçlanır, herkesin bildiği gibi yavaş edilen bir teknik bir darboğaz, in vitro olarak kolajen birikmesidir. Burada, kollajen depolanmasının önemli bir gelişme ile sonuçlanan makromoleküler kalabalık (MMC) oluşturmak için cilt kültürlerine diferansiyel boyutlu sükroz ko-polimerlerin eklenmesi içeren bir yöntem açıklanmaktadır. Özel olarak, dermal fibroblastları, kontroller ile karşılaştırıldığında MMC altında kolajen I / IV / VII ve fibronektinin önemli miktarda yatırılır.
protokol, immunocy ile kanıtlandığı gibi kültür yüzey üzerinde muhafaza edildi hücre dışı matrisin (ECM) önemli miktarda açığa kalabalık hücre tabakalarını decellularize için bir yöntem açıklanırtochemistry. Toplam matris kütlesi ve dağılım paterni girişim yansıma mikroskopi kullanılarak incelenmiştir. bileşim ve şekil değişen İlginç bir şekilde, fibroblastlar, keratinositler ve ko-kültürler üretilen hücre kökenli matrisler (CDM). CDM böylece daha klinik olarak anlamlı uygulamalar doğru hareket, kaplamalar veya iskelelerinin mevcut kullanımı genellikle ksenojenik hayvansal kaynaklardan, önlenebilir sekonder hücre ekimi için "biyo-iskeleler" olarak kullanılabilir.
Buna ek olarak, bu protokol, özellikle, dermo-epidermal bileşke (DEJ) ECM birikimini artırmak için yeterli bir 3D-Organotipik bir deri ko-kültürü modeli, kolajen VII, ana bileşen batık aşamasında MMC uygulanmasını tarif etmektedir fibrillerini ankraj. Elektron mikroskobu kontrollere kıyasla, MMC ile geliştirilen kültürlerde fibrillerin ankraj varlığını doğruladı. demirleme fibriller epidermis dermis urgan gibi bu nedenle, önemliBir önceden oluşturulmuş Olgun DEJ greft stabilitesi ve genel olarak yara iyileşme açısından deri dokusu alıcıları yararlanabilir sahip. Ayrıca, kültür süresi maliyetlerini azaltarak, MMC kullanırken, olgun bir yapı elde etmek için 3 hafta 5 hafta yoğunlaştırıldı.
Introduction
Cildin su kaybı ve patojen girişini engelleyerek koruyucu bir bariyer oluşturur. Bu üç ana bileşenden oluşur; stromal zengin dermis 1, katmanlı epidermis bunun üstüne 2,3,4 ve 5,6 arasında dermo-epidermal bileşke. Dermis ölçüde kollajen ve elastik liflerden oluşan ve seyrek fibroblastlar 7 ile doldurulur. Bunun aksine, hücre açısından zengin bir epidermis keratinositleri birden fazla katmandan oluşmaktadır. en iç tabakasının keratinositler proliferatif ve sürekli yenilemeye ve derinin en dış katmana taşımak ve uğrayarak bir kornifiye katman sonuçlanan, kendi çekirdek ve sitoplazmik malzeme kaybetmiş ölümcül ayırt keratinositleri yerine yeni bazal hücre sağlamak deskuamasyon.
dermal-epidermal bileşke, bazal membran belirli bir tip, tethe birbirine matris moleküllerinin, oluşan karmaşık bir yapıdırdermis epidermis rs. dermis kollajen I lifleri kollajen VII kolajen IV zengin lamina densa demirlemiş olan fibriller ankraj ile geçmeliye. sırayla ankraj filamentler (laminin 5, kollajen XVII ve integrinler) bazal keratinosit hemidezmozomlara ile lamina densa bağlayın. Bazal keratinositler (stratum bazale) ayırt etmek ve bazal üstü katmanları oluşturmak için tabakalandırmak yanı sıra çoğalmaya ve yenilemek kapasitesine sahip; çevre ile cildin temas yüzeyini temsil stratum spinosum, stratum granulosum ve nihayet stratum korneum. boynuzlaşan tabakaya bazal tabakadan Yolda, keratinositler Sitokeratin salgılanma modellerini değiştirmek ve nihayet apoptoz geçmesi ve boynuzlaşan kendilerini örten zarf, kovalent transglutaminaz aktivitesi ile çapraz bağlanmış olan özel proteinlerin gövde.
Karmaşık yapıları da dahil olmak üzere, deri ve in vitro katmanlarını yeniden dermal-epidermal bileşke ve dermal ekstraselüler matriks ve kornifikasyonu sürecini taklit etmek, zorlu bir görev olarak uzun ilgisini bilim adamları ve biyo-mühendisler vardır. Örneğin deri doku mühendisliğinde önemli ilerlemeler, olmuştur, hasta biyopsi alınan deri hücrelerinin başarılı çıkarma ve hasta kaynaklı cilt hücrelerini 8 kullanarak deri Organotipik kültürlerin üretimi. Bununla birlikte, çözülmemiş problemler cilt hücreleri tarafından hücre dışı matris proteinlerine zayıf salgılama kendilerini ilgili alt-optimal deri modellerinde elde kalır. Ayrıca, zaman, potansiyel makromoleküler Crowders eklenmesi ile kısaltılmış olabilir bir takvim geçerli protokolleri kullanarak 3D Organotipik cilt ko-kültür üretmek için gerekli dört ila sekiz hafta arasında değişir. kültür süresini azaltmak, reaktif maliyet tasarrufu sağlar, hücre yaşlanması insidansını azaltır ve hastanın bekleme süresi ürün klinikte kullanılması gerektiğini azaltır.
t "> makromoleküler (MMC) kalabalık hariç hacim etkileri. Bu standart sulu kültür koşulları 9-13 altında gecikmiş olan prokollajen proteolitik bölünme içeren enzimatik reaksiyon hızlarını etkileyen. MMC altında, enzimatik reaksiyonlar üretmek için kültür ortamına spesifik makromoleküllere sokulması içerir uncrowded kontrol 10 ile karşılaştırıldığında prokolajen bölünme kalabalık kültürlerinde I molekülleri kolajen artan miktarda durumunda, 14,15 sonuçlanan reaktiflerin miktarını artırmadan acele edilir. kolajen prokollajen dönüşüm olarak kollajen oluşumunu sağlar 48 saat MMC ile kültür meclisleri, fibroblastlar dört hafta 11,16,17 izlenir uncrowded fibroblast kültürleri ile karşılaştırıldığında I önemli ölçüde daha kolajen vermiştir. ECM oluşumu, istikrar ve biçimlenme etkileyen enzimatik aktivite, aynı zamanda MMC üzerindeki etkilerin yanı sıra şirketinden geliştirmek ve kollajen modüle ettiği gösterilmiştirlif oluşumu 18,19.Biz özellikle, dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositler cilt hücreleri tarafından hücre dışı matriks (ECM) üretimini artırmak için burada bir yöntem mevcut. Buna ek olarak, tek katmanlı kültürler içerisinde MMC altında üretilen zenginleştirilmiş ECM hücresizleştirilmiş ve saf hücresinden türetilen matriks (CDM) halinde kullanılabileceğini göstermektedir.
Biz görselleştirmek için bir konvansiyonel olmayan bir yaklaşım kullanır ve tam MMC ile kültüre deri hücreleri tarafından yatırılan ECM için teşekkür ederiz. Parazit yansıma mikroskopi tipik hücre-matris etkileşimleri ya da hücre-cama temas noktaları çalışmak için kullanılır. Bu teknik, cam yüzeyinde biriken matris toplam miktarını görüntülemek için sistemimizde kullanılmıştır. Parazit yansıma mikroskopi varlığı ve MMC yokluğunda, hücre dışı matris bileşimi ve düzen söz konusu bilgi en fazla miktarda elde etmek üzere floresan immün ile birleştirilmiştir.
OrganotypiCı Cilt ko-kültürler üç boyutlu bir bağlamda in vitro deri modeli için klasik bir yöntemdir. Iki boyutlu eş-kültür önemli bilgiler sağlayabilir Bu veriler çeviri ve arka doğal üç boyutlu bir yapısı olan bir in vivo ortamda, bunu uygulamada, sınırlıdır. Cilt keratinositleri, özellikle, polarize olur ve homeostaz ve hücre yapışması için gerekli olan apikal ve bazal segmentleri içerir. Buna ek olarak, keratin 1, keratin 10 ve filagrin bazal katmanın üzerinde keratinositler, tipik bazal üstü proteinlerin ekspresyonu belirlenmesi ve keratinositlerin farklılaşması sırasında sadece mevcut bulunmaktadır. terminal farklılaşma, tipik tek-tabakalı kültürler içinde hemen hemen mevcut olduğu için, bazal üstü protein ekspresyonu, normal olarak, bu kültür sisteminde elde edilemez. Bu nedenle, organotipik kültürlerinin kültür ortamı içinde daldırılmış başlar, ama daha sonra keratinocyt sürmek için bir hava-sıvı arayüz kaldırılıre farklılaşma. Bu katlama belirteçleri, daha boynuzlaşma ve epidermal fizyolojisinin genellikle daha iyi yansımasını ekspresyonu ile sonuçlanır. diğer gruplar önce başarıyla Organotipik cilt ko-kültürler meydana getirirken, fonksiyonel dermo-epidermal bileşke bölgesinde kurulması bir konu olmuştur. Burada, bir yoğunlaştırılmış bir zaman dilimi içinde, gelişmiş bir bazal membran ile Organotipik bir deri ko-kültürler kültür ve bu yapıları vadesinin ödün vermeden yeni bir yöntem. Bu in vitro model cilt mimetikleri, deri biyoloji çalışma ve eleme deneylerinin yelpazesine sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enhanced extracellular matrix is obtained upon introduction of macromolecular crowders to cell culture, owing to the excluded volume effect which increases the propeptide cleavage by proteinases. This results in extracellular matrix, in particular collagen, to be processed faster and deposited on the culture surface. While other groups have obtained thick fibroblast cell layers, it involved a culture time of several weeks20. In contrast, MMC described in this Protocol, dramatically shortens the culture time wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Biomedical Research Council, Singapore through core support to the Institute of Medical Biology and grant SPF2013/005. M.R. was supported by a NUS Faculty Research Committee Grant (Engineering in Medicine) (M.R.) R-397-000-081-112, and the NUS Tissue Engineering Program (NUSTEP). The authors would like to thank Professor Irene Leigh for providing the collagen VII antibody. Electron microscopy work was carried out at the National University of Singapore Electron Microscopy Unit.
Materials
| Ascorbic acid | Wako | 013-12061 | Cell culture media additive |
| Cell culture inserts (6-well format) | Greiner Bio-One | 657610 | Organotypic cultures |
| Citrate solution | Dako | S2369 | DakoCytomation Target Retrieval Solution Citrate, pH 6 (x10) |
| Collagen (rat tail) | Corning | 354236 | Organotypic cultures |
| CnT-57 | CELLnTEC | CnT-57 | Cell culture media |
| DAB Substrate + chromogen kit | Dako | K3468 | Histology |
| Deep-well plate (6-well format) | Corning | 355467 | Organotypic cultures |
| ECL detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent |
| Electron microscope (TEM) | JEOL | JEM-1010 (100kV) | Transmission electron microscopy |
| Fibroblast media (FM) | High Glucose-DMEM + 10% Fetal Bovine Serum + 1% Penicillin Streptomycin | ||
| Ficoll PM70 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0310-05 | Macromolecular crowder |
| Ficoll PM400 | GE Healthcare Life Sciences | 17-0300-05 | Macromolecular crowder |
| Keratinocyte serum-free media (KSFM) | Life Technologies | 17005-042 | Cell culture media |
| Lysis buffer | ThermoFisher Scientific | 89900 | Lysis buffer for protein extraction. A protease inhibitor (Roche, #11836170001) was added to this lysis buffer. |
| Microscope | Zeiss | LSM510 | Red, green and blue channels to visualize AF594, AF488 and DAPI fluorescent immunostainings (40X mag). |
| Mounting media (Hydromount) | National Diagnostics | HS-106 | Fluorescent staining |
| Mounting media (Cytoseal) | ThermoFisher Scientific | 8310-16 | Histology (HRP) |
| OCT compound (Tissue Tek) | Sakura | 4583 | Embedding for cryotomy |
| Penicillin-streptomycin antibiotics | Sigma Aldrich | A5955 | Cell culture media additive |
| Primary antibodies | |||
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | #ab6308 | |
| Anti-Collagen Type IV | Novocastra | #NCL-COLL-IV | |
| Anti-collagen VII | LH7.2 (in house) | ||
| Anti-Fibronectin antibody | Abcam | #ab2413 | |
| Reducing agent | ThermoFisher Scientific | NP0009 | Western blot |
| Sample buffer | ThermoFisher Scientific | NP0008 | Western blot |
| Secondary antibodies (Immunostaining) | |||
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | #D9542 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-11037 | |
| AlexaFluor 594 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11005 | |
| AlexaFluor 488 chicken-anti-rabbit | ThermoFisher Scientific | #A-21441 | |
| AlexaFluor 488 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific | #A-11001 | |
| Secondary antibodies (HRP) | Dako | Envision + System – HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit and Anti-Mouse | undiluted |
| Sodium deoxycholate | Prodotti Chimicie Alimentari | Decellularization | |
| Stratification media | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Ham’s F12 | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 10% fetal bovine serum | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 100U/mL penicillin and 100U/mL streptomycin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 0.4mg/mL hydrocortisone | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL insulin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 1.8·10-4 M adenine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 5mg/mL transferrin | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| 2·10- 11 M triiodothyronine | Used during the air-liquid interface of organotypic cultures. This media is added to the outside of the cell-culture insert. | ||
| Trypsin | Biopolis Shared Facilities | 0.125% Trypsin/Versene pH 7.0 + 0.3 | Used to trypsinize cells |
References
- Breitkreutz, D., Mirancea, N., Nischt, R. Basement membranes in skin: unique structures with diverse functions. Histochem Cell Biol. 132 (1), 1-10 (2009).
- Lane, E. B., et al. mutation in the conserved helix termination peptide of keratin 5 in hereditary skin blistering. Nature. 356 (6366), 244-246 (1992).
- Fuchs, E., Raghavan, S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).
- Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. J Invest Dermatol. 127 (11), 2525-2532 (2007).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacol Rev. 61 (2), 198-223 (2009).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell Tissue Res. 339 (1), 237-246 (2010).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (Pt 24), 4195-4200 (2010).
- Ghalbzouri, A., Jonkman, M., Dijkman, R., Ponec, M. Basement membrane reconstruction in human skin equivalents is regulated by fibroblasts and/or exogenously activated keratinocytes. J Invest Dermatol. 124 (1), 79-86 (2005).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Harve, K. S., Peng, Y. X., Raghunath, M. In Vitro Enhancement of Collagen Matrix Formation and Crosslinking for Applications in Tissue Engineering–a Preliminary Study. Tiss Eng. 13 (2), 385-391 (2007).
- Lareu, R. R., et al. Collagen matrix deposition is dramatically enhanced in vitro when crowded with charged macromolecules: the biological relevance of the excluded volume effect. FEBS Lett. 581 (14), 2709-2714 (2007).
- Lareu, R. R., Harve, K. S., Raghunath, M. Emulating a crowded intracellular environment in vitro. dramatically improves RT-PCR performance. Biophys Biochem Res Comm. 363 (1), 171-177 (2007).
- Harve, K. S., Ramakrishnan, V., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Macromolecular crowding in vitro as means of emulating cellular interiors: when less might be more. Proc Natl Acad USA Sci. 105 (51), E119 (2008).
- Chen, C., et al. The Scar-in-a-Jar: Studying antifibrotic lead compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. Br J Pharmacol. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Harve, K. S., Lareu, R., Rajagopalan, R., Raghunath, M. Understanding how the crowded interior of cells stabilizes DNA/DNA and DNA/RNA hybrids-in silico predictions and in vitro evidence. Nucleic Acids Res. 38 (1), 172-181 (2009).
- Satyam, A., et al. Macromolecular crowding meets tissue engineering by self-assembly: A paradigm shift in regenerative medicine. Adv Mat. 26 (19), 3024-3034 (2014).
- Chen, C. Z. C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Rashid, R., et al. Novel use for Polyvinylpyrrolidone as a Macromolecular Crowder for Enhanced Extracellular Matrix Deposition and Cell Proliferation. Tiss Eng C. , (2014).
- Dewavrin, J. Y., Hamzavi, N., Shim, V. P. W., Raghunath, M. Tuning the Architecture of 3D Collagen Hydrogels by Physiological Macromolecular Crowding. Acta Biomaterialia. 10 (10), 4351-4359 (2014).
- Dewavrin, J. Y., et al. Synergistic Rate Boosting of Collagen Fibrillogenesis in Heterogeneous Mixtures of Crowding Agents. J Phys Chem B. 119 (12), 4350-4358 (2015).
- Auger, F. A., Berthod, F., Moulin, V., Pouliot, R., Germain, L. Tissue engineered skin substitutes: from in vitro constructs to in vivo applications. Biotechnol Appl Biochem. 39, 263 (2004).
- Chen, B., et al. Macromolecular crowding effect on cartilaginous matrix production: a comparison of two-dimensional and three-dimensional models. Tiss Eng Part C Methods. 19 (8), 586-595 (2013).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., van Vliet, K. J. Macromolecular crowding directs extracellular matrix organization and mesenchymal stem cell behavior. PLOS One. 7 (5), e37904 (2012).
- Kumar, P., et al. Macromolecularly crowded in vitro microenvironments accelerate the production of extracellular matrix-rich supramolecular assemblies. Scientific Reports. 5, 8729 (2015).
- Ang, X. M., et al. Macromolecular crowding amplifies adipogenesis of human bone marrow-derived MSCs by enhancing the pro-adipogenic microenvironment. Tiss Eng Part A. 20 (5-6), 966-981 (2014).
- Peng, Y. X., et al. Human Fibroblast Matrices Bioassembled Under Macromolecular Crowding Support Stable Propagation Of Human Embryonic Stem Cells. J Tiss Eng Regen Med. 6 (10), e74-e84 (2012).
- Benny, P., Badowski, C., Lane, E. B., Raghunath, M. Making More Matrix: Enhancing the deposition of dermal-epidermal junction components in vitro and accelerating organotypic skin culture development, using macromolecular crowding. Tiss Eng A. 21 (1-2), 182-192 (2015).
