تدفق نمط تلفيق إرشادية للعالي الكثافة الباركود الأجسام المضادة ميكروأري
Summary
ويحدد هذا البروتوكول تصنيع على نطاق واسع، ثنائية الأبعاد DNA أو الأجسام المضادة مجموعة المضاعفة، مع التطبيقات المحتملة في الخلية دراسات الإشارات وكشف العلامات البيولوجية.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
وقد استخدمت المجهرية الأجسام المضادة على نطاق واسع في الدراسات البروتين لعقود من الزمن لدراسة وجود البروتينات المستهدفة، بما في ذلك المؤشرات الحيوية البروتين 1-3. على الرغم من أن هذا المجال يواجه حاليا تحديات كبيرة من تقنيات عالية الإنتاجية الأخرى مثل مطياف الكتلة (MS)، لا يزال هناك الكثير من الغرفة لفائدة ميكروأرس الأجسام المضادة، وذلك أساسا بسبب هذه الأجهزة تحمل تفسير البيانات بسيطة وسهلة واجهة مع فحوصات أخرى. في السنوات الأخيرة، وقد وفرت دمج المجهرية في السقالات رقاقة ميكروأري الأجسام المضادة فرصة جديدة للازدهار 4-7. على سبيل المثال، تم استخدام ميكروأري الباركود دمجها في رقاقة وحيدة الخلية في دراسات الاتصالات الخلوية 8،9. هذه التقنية لها مزايا مميزة على غيرها من التكنولوجيات ميكروأري المتاحة. ويضم عناصر مجموعة في 10-100 ميكرون، أصغر بكثير من نموذجي 150 ميكرون حجم المستخدمة في elemen ميكروأري التقليديةنهاية الخبر. ويتحقق بناء عناصر مجموعة أصغر باستخدام نهج تدفق الزخرفة المنهجية، وهذا يؤدي إلى ميكروأرس المدمجة التي يمكن الكشف عن البروتينات وحيدة الخلية تفرز الخلايا والبروتينات. ميزة أخرى هي استخدام بسيطة، خالية من أداة الإعداد. هذا مهم بشكل خاص، لأن معظم المعامل والشركات الصغيرة قد لا تكون قادرة على الوصول إلى المرافق الأساسية ميكروأري. هذا الباركود المجهرية الضد تشمل الخصائص المتطورة مقايسة الإنتاجية، ويمكن استخدامها لإجراء فحوصات المضاعفة كبير على الخلايا وحيدة حين تحقيق حساسية عالية وخصوصية مقارنة مع تلك التي التقليدي المرتبط بالإنزيم شطيرة الفحص المناعي (ELISA 8). وقد وجدت هذه التقنية العديد من التطبيقات في الكشف عن البروتينات من ورم أرومي 11/09، وخلايا T 12، وتعميم الخلايا السرطانية 13. بدلا من ذلك، ميكروأرس DNA الباركود وحده استخدمت في تحديد المواقع بدقة من الخلايا العصبية والخلايا النجمية لميميكجي التجميع في الجسم الحي من أنسجة المخ 14.
ويركز هذا البروتوكول فقط على الخطوات التجريبية وكتل تراكم من ثنائي الأبعاد (2-D) الباركود الأجسام المضادة ميكروأري التي لها تطبيقات محتملة في الكشف عن المؤشرات الحيوية في عينات الموائعية وفي زنازين انفرادية. وتستند هذه التقنية على عنونة احد الذين تقطعت بهم السبل، أحادية البعد (1-D) ميكروأري DNA شيدت باستخدام [أليغنوكليوتيد المتعامدة التي يتم نمط مكانيا على ركائز الزجاج. يتم تشكيل نمط 1-D عندما تستخدم قنوات تدفق موازية في خطوة تدفق الزخرفة، ويبدو مثل هذا النمط كما عصابات منفصلة مماثلة بصريا إلى 1-D رمز المنتج العالمي (UPC) الباركود. بناء 2-D (ن س م) الأجسام المضادة مجموعة – يذكرنا 2-D الاستجابة السريعة (QR) رمز المصفوفة – يحتاج استراتيجيات الزخرفة أكثر تعقيدا، ولكن يسمح لتجميد الأجسام المضادة في ارتفاع الكثافة 8،15. تلفيقيتطلب خطوتين الزخرفة DNA، مع النمط الأول عمودي على الثانية. نقاط تقاطع هذه الأنماط اثنين تشكل عناصر م ن خ المصفوفة. عن طريق اختيار استراتيجي تسلسل واحد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) المستخدمة في تدفق الزخرفة، يتم تعيين كل عنصر في مجموعة وإعطاء عنوان محدد. هذه الإشارة المكانية اللازمة في التمييز بين الإشارات مضان على الشريحة ميكروأري. تحويل مجموعة ssDNA في صفيف الأجسام المضادة من خلال إدراج تقارن-DNA الأجسام المضادة التكميلية، وتشكيل منصة تسمى مكتبة الأجسام المضادة ترميز الحمض النووي (DEAL 16).
يصف هذا البروتوكول الفيديو الخطوات الرئيسية في خلق صفائف nxm الأجسام المضادة والتي تشمل إعداد polydimethylsiloxane (PDMS) قوالب الباركود، وتدفق الزخرفة ssDNA في اثنين من التوجهات، وإعداد الأجسام المضادة النوكليوتيد تقارن DEAL، وتحويل مجموعة 3 × 3 DNA إلى 3× 3 الضد مجموعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصميم نمط تدفق هو أول خطوة حاسمة في افتعال ميكروأري 2-D. لتوليد اثنين من تداخل أنماط الحمض النووي على ركيزة الزجاج، ويجب الميزات قناة للتصميم الأول أن يكون عمودي على تلك الثاني (الشكل 1A-B). النظر في التصاميم أيضا التطبيقات المصب ميكروأري. في حالة تحليل خلي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
