उच्च घनत्व बारकोड एंटीबॉडी माइक्रोएरे का प्रवाह पैटर्न गाइडेड निर्माण
Summary
इस प्रोटोकॉल सेल संकेत अध्ययन और बायोमार्कर का पता लगाने में संभावित अनुप्रयोगों के साथ एक बड़े पैमाने पर निर्माण, मल्टिप्लेक्स दो आयामी डीएनए या एंटीबॉडी सरणी, रूपरेखा।
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
एंटीबॉडी व्यापक रूप से प्रोटीन बायोमार्कर 1-3 सहित लक्षित प्रोटीन की मौजूदगी की जांच करने के लिए दशकों से प्रोटिओमिक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। इस क्षेत्र वर्तमान में इस तरह मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के रूप में अन्य उच्च throughput प्रौद्योगिकियों से बड़ी चुनौतियों का सामना करना पड़ रहा है हालांकि, इन उपकरणों के अन्य assays के साथ सरल डेटा व्याख्या और आसान इंटरफेस बर्दाश्त मुख्य रूप से, क्योंकि अभी भी एंटीबॉडी की उपयोगिता के लिए कमरे के पास बहुत है। हाल के वर्षों में, माइक्रोचिप मचानों में प्रोटीन का एकीकरण एंटीबॉडी माइक्रोएरे 4-7 कामयाब करने के लिए एक नया अवसर प्रदान किया है। उदाहरण के लिए, एक एकल कोशिका माइक्रोचिप में एकीकृत बारकोड माइक्रोएरे सेल संचार अध्ययन 8,9 में इस्तेमाल किया गया है। यह तकनीक अन्य उपलब्ध माइक्रोएरे प्रौद्योगिकियों पर विशिष्ट फायदे हैं। यह पारंपरिक माइक्रोएरे elemen में इस्तेमाल ठेठ 150 माइक्रोन आकार की तुलना में बहुत छोटे 10-100 माइक्रोन, पर सरणी तत्वों की सुविधाटीएस। छोटे सरणी तत्वों का निर्माण व्यवस्थित प्रवाह patterning के दृष्टिकोण का उपयोग कर हासिल की है, और इस एकल कोशिका स्रावित प्रोटीन और intracellular प्रोटीन का पता लगा सकते हैं कि कॉम्पैक्ट प्रोटीन को जन्म देता है। एक और लाभ यह एक सरल, साधन-मुक्त सेटअप का उपयोग है। सबसे प्रयोगशालाओं और छोटी कंपनियों के माइक्रोएरे कोर सुविधाओं का उपयोग करने में सक्षम नहीं हो सकता है, क्योंकि यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। बारकोड एंटीबॉडी परख थ्रूपुट बढ़ाया सुविधा और पारंपरिक सैंडविच एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख के साथ तुलना उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता (एलिसा 8) प्राप्त है, जबकि एकल कक्षों पर अत्यधिक मल्टिप्लेक्स assays के प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह तकनीक ट्यूमर कोशिकाओं को 13 ग्लियोब्लास्टोमा 9-11 से प्रोटीन, टी कोशिकाओं 12 का पता लगाने, और प्रचलन में कई आवेदन मिल गया है। वैकल्पिक रूप से, बारकोड डीएनए अकेले mimick के लिए न्यूरॉन्स और astrocytes की सटीक स्थिति में उपयोग किया गया हैमस्तिष्क के ऊतकों 14 के vivo विधानसभा हैैं।
इस प्रोटोकॉल केवल प्रयोगात्मक कदम और fluidic नमूनों में बायोमार्कर का पता लगाने में संभावित आवेदन किया है, जो दो-आयामी (2 डी) बारकोड एंटीबॉडी माइक्रोएरे का निर्माण हुआ ब्लॉकों पर और एकल कक्षों में केंद्रित है। प्रौद्योगिकी एक पता, एकल असहाय एक आयामी (1 डी) डीएनए माइक्रोएरे पर आधारित है गिलास substrates पर स्थानिक नमूनों हैं कि ओर्थोगोनल oligonucleotides के प्रयोग का निर्माण किया। समानांतर प्रवाह चैनलों प्रवाह patterning के चरण में इस्तेमाल किया जाता है, जब 1-डी पैटर्न का गठन किया है, और इस तरह के एक पैटर्न 1-डी यूनिवर्सल उत्पाद कोड (यूपीसी) बारकोड को नेत्रहीन समान असतत बैंड के रूप में प्रकट होता है। 2-डी (एन एक्स एम) एंटीबॉडी सरणी का निर्माण – एक 2-डी त्वरित प्रतिक्रिया (मूल्यांकन) मैट्रिक्स कोड की याद ताजा करती है – और अधिक जटिल patterning रणनीतियों की जरूरत है, लेकिन एक उच्च घनत्व 8,15 पर एंटीबॉडी के स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है। संरचनादूसरी सीधा करने के लिए पहले पैटर्न के साथ दो डीएनए patterning के कदम की आवश्यकता है। इन दो पैटर्न के चौराहे के अंक सरणी के एन एक्स एम तत्वों का गठन। रणनीतिक रूप से प्रवाह patterning में उपयोग एकल असहाय डीएनए (ssDNA) के दृश्यों का चयन करके, एक दिया सरणी में प्रत्येक तत्व एक विशिष्ट पते सौंपा है। यह स्थानिक संदर्भ माइक्रोएरे स्लाइड पर प्रतिदीप्ति संकेतों के बीच भेद करने में आवश्यक है। ssDNA सरणी (सौदा 16) डीएनए इनकोडिंग एंटीबॉडी पुस्तकालय नामक एक मंच के गठन, पूरक डीएनए एंटीबॉडी conjugates के समावेश के माध्यम से एक एंटीबॉडी सरणी में बदल जाती है।
इस वीडियो प्रोटोकॉल, दो झुकाव में तैयारी में शामिल हैं जो nxm एंटीबॉडी polydimethylsiloxane (PDMS) बारकोड नए नए साँचे, प्रवाह patterning ssDNA बनाने एंटीबॉडी oligonucleotide सौदा conjugates, तैयारी और एक 3 में 3 एक्स 3 डीएनए सरणी में परिवर्तित करने में महत्वपूर्ण कदम का वर्णनएक्स 3 एंटीबॉडी सरणी।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रवाह पैटर्न डिजाइन 2-डी माइक्रोएरे fabricating में पहला महत्वपूर्ण कदम है। एक गिलास सब्सट्रेट पर दो ओवरलैपिंग डीएनए पैटर्न उत्पन्न करने के लिए, पहली डिजाइन के चैनल सुविधाओं दूसरा (चित्रा 1 ए-बी) के ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
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