Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays
Summary
Este protocolo describe la fabricación de una gran escala, multiplexado de ADN o anticuerpo matriz de dos dimensiones, con aplicaciones potenciales en los estudios de la señalización celular y la detección de biomarcadores.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Microarrays de anticuerpos han sido ampliamente utilizados en estudios proteómicos durante décadas para examinar la presencia de proteínas específicas, incluyendo biomarcadores proteicos 1-3. Aunque este campo se enfrenta actualmente a grandes retos de otras tecnologías de alto rendimiento, tales como la espectrometría de masas (MS), todavía hay mucho espacio para la utilidad de los microarrays de anticuerpos, principalmente debido a que estos dispositivos ofrecen la interpretación de datos simple y fácil interfaz con otros ensayos. En los últimos años, la integración de los microarrays en andamios microchip ha proporcionado el microarray anticuerpo una nueva oportunidad para prosperar 4-7. Por ejemplo, el microarray de código de barras integrado en un microchip de una sola célula se ha utilizado en estudios de comunicación celular 8,9. Esta tecnología tiene ventajas distintivas con respecto a otras tecnologías de microarrays disponibles. Cuenta con elementos de la matriz de 10-100 micras a, mucho menor que el 150 micras tamaño típico utilizado en elemen microarrays convencionalests. La construcción de elementos de la matriz más pequeños se consigue utilizando enfoques sistemáticos de flujo de modelado, y esto da lugar a microarrays compactos que pueden detectar las proteínas de una sola célula secretadas y proteínas intracelulares. Otra ventaja es el uso de una configuración simple,-instrumento libre. Esto es particularmente importante, ya que la mayoría de los laboratorios y las pequeñas empresas pueden no ser capaces de acceder a las instalaciones centrales de microarrays. Tal código de barras microarrays de anticuerpos de funciones mejorado rendimiento del ensayo y se pueden usar para realizar ensayos altamente multiplexados en células individuales mientras que el logro de alta sensibilidad y especificidad comparable con la de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich convencional (ELISA 8). Esta tecnología ha encontrado numerosas aplicaciones en la detección de proteínas de glioblastoma 9-11, células T 12, y células tumorales circulantes 13. Alternativamente, microarrays de ADN de código de barras solo se han utilizado en el posicionamiento preciso de neuronas y astrocitos para mimicking la asamblea en vivo de tejido cerebral 14.
Este protocolo se centra sólo en las etapas experimentales y bloquea la acumulación de las dos dimensiones (2-D) de código de barras de microarrays de anticuerpos que tiene aplicaciones potenciales en la detección de biomarcadores en muestras de fluidos y en células individuales. La tecnología se basa en una direccionable de una sola hebra, unidimensional (1-D) de microarrays de ADN construidos utilizando oligonucleótidos ortogonales que se modelan espacialmente sobre sustratos de vidrio. El patrón 1-D se forma cuando se utilizan canales de flujo paralelos en el paso de flujo patrón, y tal patrón aparece como bandas discretas visualmente similares a 1-D Código Universal de Producto (UPC) los códigos de barras. La construcción de un 2-D (n x m) matriz de anticuerpos – una reminiscencia de un código de la matriz 2-D de respuesta rápida (QR) – necesita estrategias de modelado más complejas, pero permite la inmovilización de anticuerpos a una densidad mayor 8,15. La fabricaciónrequiere dos pasos de modelado de ADN, con el primer patrón perpendiculares a la segunda. Los puntos de intersección de estos dos patrones constituyen los elementos de m x n de la matriz. Al seleccionar estratégicamente las secuencias de ADN de cadena sencilla (ssDNA) utilizado en flow-patrón, cada elemento de una matriz dada es asignada una dirección específica. Es necesario Esta referencia espacial para distinguir entre las señales de fluorescencia en la diapositiva de microarrays. La matriz de ssDNA se convierte en una matriz de anticuerpos a través de la incorporación de los conjugados anticuerpo-ADN complementarios, formando una plataforma llamada ADN codificado biblioteca de anticuerpos (DEAL 16).
Este protocolo de vídeo se describen los pasos clave en la creación de matrices nxm anticuerpos que incluyen la preparación de polidimetilsiloxano (PDMS) moldes de código de barras, flujo-patrón ssDNA en dos orientaciones, la preparación de los conjugados anticuerpo-DEAL oligonucleótidos, y la conversión de la matriz de ADN 3 x 3 en un 3x 3 matriz de anticuerpos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diseño del patrón de flujo es el primer paso crítico en la fabricación de los microarrays 2-D. Para generar dos patrones de ADN superpuestas sobre un sustrato de vidrio, las características de canal del primer diseño deben ser perpendiculares a las de la segunda (Figura 1A-B). Los diseños también consideran que las aplicaciones posteriores de los microarrays. En el caso del análisis de una sola célula, el microarray se utiliza para detectar proteínas a partir de células individuales…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
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