Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon
Summary
Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir.
Abstract
Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.
Introduction
Antikor mikroarrayleri çok protein biyo-1-3 de dahil olmak üzere hedef proteinler, varlığını incelemek için yıllardır proteomik çalışmalarda kullanılmıştır. Bu alan şu anda böyle kütle spektrometresi (MS) gibi diğer yüksek verimli teknolojilerin büyük zorluklarla karşı karşıya olmasına rağmen, bu cihazlar diğer tahlillerde basit veri yorumlama ve kolay arayüzü göze başlıca nedeni, hala antikor mikrodizilerinin programı için oda bol. Son yıllarda, mikroçip iskelelerinin içine microarrays entegrasyonu antikor mikrodizisini 4-7 gelişmek için yeni bir fırsat sağladı. Örneğin, bir tek hücre mikroçip entegre barkod mikroarray hücre iletişim çalışmaları 8,9 kullanılmıştır. Bu teknoloji mevcut diğer mikroarray teknolojilere kıyasla belirgin avantajları vardır. Geleneksel mikroarray Elemen kullanılan tipik 150 mikron boyutunda çok daha küçük 10-100 um en dizi öğelerine sahipts. Daha küçük dizi elemanlarının yapımında sistematik bir akım-desen yaklaşımlar kullanılarak elde edilir ve bu da tek hücreli salgılanan proteinleri ve hücre içi proteinleri tespit kompakt mikrodiziler yol açmaktadır. Bir başka avantaj, basit bir alet içermeyen kurulum kullanılmasıdır. En laboratuarlar ve küçük şirketler mikrodizin çekirdek tesisleri erişmek mümkün olmayabilir, çünkü bu özellikle önemlidir. Bu barkod antikor mikrodizileri deney hacmi geliştirilmiş özelliği geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent deneyi ile karşılaştırılabilir yüksek hassasiyet ve özgüllük (ELISA 8) elde ederken tek hücreler üzerinde oldukça çoğaltılmış çok katlı testleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji tümör hücrelerini 13 glioblastoma 9-11 proteinleri, T hücreleri 12 tespit ve dolaşımdaki sayısız uygulamaları bulmuştur. Alternatif olarak, barkod DNA mikrodizileri yalnız taklit eden için nöronların ve astrositlerin hassas konumlandırma kullanılmıştırBeyin dokusunda 14 in vivo montajını ing.
Bu protokol, sadece deneysel adımlar ve akışkan numunelerde biyomarkerların tespiti potansiyel uygulamalar vardır, iki boyutlu (2-D) barkod antikor mikroarray birikmesi bloklar ve tek hücre odaklanır. Teknoloji adresli, tek sarmallı tek boyutlu (1-D) DNA mikro-dizisi dayanan cam yüzeylerde mekansal desenli ortogonal oligonükleotidler kullanılarak oluşturulabilir. Paralel akış kanalları akış desen aşamasında kullanılan zaman 1-D desen oluşturulur ve böyle bir model 1-D, Evrensel Ürün Kodu (UPC) barkod görsel olarak benzer ayrı bantlar olarak görünür. 2-D (n x m) antikor dizisinin yapım – 2-B Quick Response (QR) matris kod anımsatan – daha karmaşık desenlendirme stratejilerini gerekiyor, ancak daha yüksek bir yoğunluğa 8,15 olarak antikorların immobilizasyonu sağlar. Uydurmaikinci dik ilk şekil iki DNA model verme adımları gerektirir. Bu iki desen kesişme noktaları dizisi n x m unsurlarıdır. Stratejik akış desen kullanılan tek şeritli DNA (ssDNA) dizileri seçerek belirli bir dizideki her eleman belirli bir adresi atanır. Bu mekansal referans mikrodizi slayt floresan sinyalleri ayırt gereklidir. SsDNA dizisi (İDEAL 16), DNA tarafından kodlanan bir antikor kütüphanesi olarak bir platform oluşturan tamamlayıcı DNA-antikor konjugatları dahil edilmesi yoluyla bir antikor dizisine dönüştürülür.
Bu video protokol iki yönlerde hazırlanması dahil nxm antikor dizileri polidimetilsiloksan (PDMS) barkod kalıpları, akış-desen oluşturma ssDNA antikor oligonükleotid İDEAL konjugatlarının hazırlanması ve 3 içine 3 x 3 DNA dizisi dönüştürülmesi önemli adımları açıklamaktadırx 3 antikor dizisi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akış desen tasarımı 2-D mikrotertibi imalatı ilk kritik adımdır. Bir cam substrat üzerinde iki çakışan DNA desenleri oluşturmak için, ilk tasarım özellikleri, ikinci kanal (Şekil 1A-B) olan dik olmalıdır. Tasarımları da mikrotertibin aşağı uygulamalarını düşünün. Tek bir hücre analizi durumunda, mikro-dizi, bu nedenle kanal boyutları 2-D dizileri aynı hizaya microchambers uyumlu yapılır microchambers içine tek hücre proteinleri tespit etmek için kul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.
Materials
| Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning | 3097366-1004 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning | 3097358-1004 | |
| SU-8 2025 photoresist | MicroChem | Y111069 | |
| Silicon wafers | University Wafers | 452 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Thermo Scientific | C40-5257-M20 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | *Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see table below | |
| Poly-L-lysine adhesive stock solution | Newcomer Supply | 1339 | |
| Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3) | Thermo Scientific | 21585 | |
| 1x Phosphate buffered saline, pH 7.4 | Quality Biological | 114-058-101 | |
| Äkta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System | GE (Amersham Pharmacia) | 18-1112-41 | |
| Superose 6 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Capture antibodies | various | various | *Antibody selection depends on application |
| Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic) | Solulink | S-1002 | |
| Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB) | Solulink | S-1004 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| Citric acid, anhydrous | Acros | 42356 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318 | |
| Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO | EMD Millipore | UFC201024 | |
| Spin coater | Laurell Technologies | WS-650-MZ | |
| Biopsy punch with plunger (0.50 mm diameter) | Electron Microscopy Sciences | 57393 | |
| Diamond scribe (Style 60) | SPI supplies | 6004 | |
| Trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 92361 |
References
- Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. Oncoproteomic profiling with antibody microarrays. Genome Med. 1 (7), (2009).
- Angenendt, P. Progress in protein and antibody microarray technology. Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).
- Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. Recent advances in microarray technologies for proteomics. Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).
- Fan, R., et al. Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood. Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).
- Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. Single-cell technologies for monitoring immune systems. Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).
- Ma, S., et al. Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria. Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).
- Wang, J., et al. Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells. Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).
- Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).
- Xue, M., et al. Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells. J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).
- Shi, Q. H., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).
- Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).
- Deng, Y., et al. An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells. Sci Rep. 4, 7499 (2014).
- Vermesh, U., et al. High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications. Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).
- Yu, J., et al. Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications. Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).
- Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).
- Alegria-Schaffer, A. General protein-protein cross-linking. Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).
- Ahmad, H., et al. A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins. Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).
