단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

요약

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

초록

이 프로토콜은 방법은 정량적 수행하기 위해 제공, 현장에서 단일 셀 혈통 사양을 연구하는 단백질 발현 분석 마우스 착상 전 배아에서. 배아 수집, 면역, 공 초점 현미경 영상 및 이미지 세분화 및 분석에 필요한 절차를 설명한다. 이 방법은 여러 핵 마커의 발현 및 공간 (XYZ)의 정량은 태아의 모든 셀의 좌표를 허용한다. 그것은 MINS, 특히 착상 전 배아 및 배아 줄기 세포 (ESC) 식민지의 공 초점 이미지의 분석을 위해 개발 한 이미지 분할 소프트웨어 툴을 활용합니다. 분 X, Y 및 Z 차원 걸쳐 자율 핵 세그멘테이션을 수행하고, 최소한의 사용자 입력을 모든 채널에 대해 3 차원 공간에서 셀의 위치에 대한 정보뿐만 아니라, 핵 형광 레벨을 생성한다. 이 프로토콜은 화상의 분석을 위해 최적화되어 있지만착상 전 단계의 마우스 배아, 그것은 쉽게 양호한 신호 대 잡음비 및 여기서 높은 핵 밀도 (이미지 분할에 장애물 포즈 등., 배아 줄기 세포의 발현 분석을 나타내는 임의의 다른 시료의 분석 (ESC에 적용 할 수있다 ) 식민지 문화의 셀, 다른 종 또는 단계 등)의 배아를 차별화.

서론

마우스 착상 전 배아 세포 운명 명세서 및 포유 동물에서 상피 새로이 연구 출현 생체 능성의 유지뿐만 아니라, 모델을 학습하는 패러다임이다. 두 배외 (extraembryonic) 계통, trophectoderm (TE)와 - 대부분의 체세포 조직 및 생식 세포에 상승을 제공 - 포유류 개발의 착상 전 단계는 배반포, 즉 만능 epiblast을 구성하는 세 가지 세포 계통의 확립에 최선을 다하고 있습니다 원시 내배엽 (예정) (그림 1A) ^1,2. 이 프로토콜은, (2), 관심의 단백질을 라벨 면역 형광을 수행 (3) Z-절편 기능과 함께 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 마운트 전체 수행 (1) 수확 및 수정 착상 전 단계 마우스 배아에 대한 절차를 설명 (4) 공 초점 이미지와 이후의 양적 이미지 분석의 핵 분할을 수행합니다. 이 파이프 라인은 t 수 있습니다그 자리에서 세포의 개체군을 특성화 셀 아이덴티티 할당을 위해 단백질 수준을 측정 바이어스. 데이터 분석 (도 1b)에 배아 컬렉션 (일반적으로 10 마우스 배아까지) 한 쓰레기 4 일 -이 프로토콜은 적은 3로 수행 될 수있다. 여러 리터의​​ 동시 분석에 따라서 프로토콜의 전체 길이를 연장하는, 촬상....

프로토콜

윤리 문 : 모든 동물의 작업, 사육, 번식과 희생을 포함하여이 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), 프로토콜 번호 03-12-017에 의해 승인되었다.

1. 배아 컬렉션

모든 동물의 작업은 기관 및 지방 자치 단체의 승인을 받아야합니다, 지역 및 기관 규칙을 준수 :합니다.

1. 원하는 유전자형의 비옥 한 스터드 남성과 처녀 암컷 마우스 메이트.
   참고 : estral주기의 발정 단계에서 여성을 선택, 자연 교배를 설정 원하는 날짜에 교미의 기회를 증가합니다. 과배란을 유도하는 경우, ^(20)에 기술 된 프로토콜을 참조하십시오.
2. 무딘 프로브를 사용하여 아침에 질 플러그의 존재를 확인합니다. 교미 플러그가 하루 종일 손실로 이상적으로, 정오 (오후 12시) 전에이 작업을 수행. NOO 고려질 플러그 배아 일 (E) 0.5 N의 검출.
3. 원하는 날짜와 배아 발달의 시간에, M2 또는 RT로 세척 들고 매체 (FHM) 또는, 바람직하게는, 37 ºC을 따뜻하게. 참고 : 어느 M2 또는 FHM이 세척 및 취급 배아를....

결과

데이터 해석 및 프리젠 테이션을 용이하게하기 위해주의가 모든 세포의 상대적인 위치를 분석 할 수 있도록, 수집 및 조작시 배아를 손상시키지 않도록주의해야한다도 2a를 -. D는 팽창 캐비티와 다른 단계에서 그대로 포배의 예를 나타낸다. 발생하는 손상 경우, 별도의주의를 분석하고 결과를 해석 할 때주의해야한다.

이 프로토콜을 이용하여 생성 된 데이터의 품질과 신뢰성이 정착 품질에 대한 관심의 단백질을 검출하기 위해 사용 된 항체의 신호 대 잡음 비에 의존한다. 항상 신선한 정착액을 사용하여 실험 세트를 시작하기 전에, 적절한 양성 및 음성 컨트롤, 새로운 항체를 테스트합니다. 그림 2a는 핵 단백질의 수에 대한 좋은 항체의 예를 보여줍니다. 그림 2b는 exampl를 보여.......

토론

본 프로토콜은 착상 전 단계 마우스 배아에서 전체 마운트 면역의 정량 분석​​을 수행하는 방법을 설명합니다. 강력한 면역 프로토콜 ^(22)는 고해상도의 뒤에, ^(4)의 소프트웨어 맞춤 부재를 사용하는 공 초점 이미지 및 이미지 분할을하여 전체를 실장. 면역 프로토콜의 선택은 중요하지 않지만, 우리는 빠르고 안정적으로 우리는 시험 한 항체의 많은 강력한 신호를 제공하기 위해 여기 ²² 제시 한 검색. 다음 될 수있는 다른 프로토콜, 애플리케이션은 동일 실험에서 일관 제공된다. 여러 가지 요소가 반드시 할 수 없습니다 실험 사이의 각 개별 실험의 결과와 직접 비교에 영향을 미치는 동안, 우리는 반복 일관성을 위해 노력하고 충분한 기술적 복제를 수행하는 큰 변동성을 줄일 것으로 나타났습니다. 따라서, 한 번 최적화, 고정 및 immunolabeling 시약 및 프로토콜뿐만 아니라, 촬상 조건이 동등 실험 간의 일정하게 유지되어야한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Embryo collection
Blunt probe for plug check roboz		RS-9580
집게	roboz	RS-4978
수술 가위	roboz	rs-5910
유리 파스퇴르 피펫	Fisher	13-678-20C
사전 조립된 흡인기 튜브 & 마우스피스	Sigma	A5177
긴 고무 튜빙	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
Acid Tyrode의 용액	Millipore	MR-004-D
페니실린/스트렙토마이신	Gibco	15140
소 혈청 알부민	Sigma	A9647
4-웰 플레이트	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
Immunofluorescence
96-well U-bottom plates	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
Glycine	Sigma	G7403
Horse serum	Sigma	H0146
Primary antibodies			<강한>농도
CDX2	바이오제넥스	AM392-5M	1:200
GATA6	R& D	AF1700	1:100
GATA4	산타 크루즈	sc-9053	1:100, 10 분 고정
GATA4	산타 크루즈	sc-1237	1:100, O / N 고정
SOX17	R & D	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1:100, O/N 고정까지 10분
DAB2	BD	BD-610464	1:200
2차 항체	Life Technologies	Various	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
이미징
35mm 유리 바닥 접시	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
Computer running 64-bit Windows OS		n/a	http://katlab-tools.org 및 Lou et al., (2014) Stem Cell Reports
MATLAB (software)	에서 최소 시스템 요구 사항 확인Mathworks	해당 없음
MINS (소프트웨어)	무료	해당 없음	http://katlab-tools.org