Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
Hjerneinfarkt initierer en robust betennelsesreaksjon som starter i intrarommet og innebærer rask aktivering av hjernen bosatt celler. En viktig mekanisme i denne inflammatoriske respons er migrering av sirkulerende immunceller til den iskemiske hjerne lettes ved kjemokinet frigivelse og økt endotel-adhesjonsmolekyl uttrykk. Brain-invaderende leukocytter er velkjent bidra til tidlig stadium sekundær iskemisk skade, men deres betydning for terminering av betennelse og senere hjernen reparasjon har nylig blitt lagt merke til.
Her blir en enkel protokoll for effektiv isolering av immunceller fra mus iskemiske hjerne tilgjengelig. Etter transcardial perfusjon, er hjernehalvdelene dissekert og mekanisk dissosiert. Enzymatisk spaltning med Liberase er etterfulgt av tetthets-gradient (som Percoll) sentrifugering for å fjerne myelin og celleavfall. En stor fordel med denne protokollen is single-layer tetthetsgradient fremgangsmåte som ikke krever tidkrevende fremstilling av gradienter, og kan bli pålitelig gjennomført. Tilnærmingen gir svært reproduserbare celler per hjernen halvkule og åpner for å måle flere flowcytometri paneler i en biologisk replikere. Fenotypisk karakterisering og kvantifisering av hjerne-invaderende leukocytter etter eksperimentell hjerneslag kan bidra til en bedre forståelse for deres mangefasetterte roller i iskemisk skade og reparasjon.
Cerebral slag utløser en vedvarende inflammatorisk reaksjon som starter raskt etter opphør av den lokale blodstrøm og omfatter praktisk talt alle deler av immunsystemet. Et viktig kjennetegn på denne betennelsesreaksjon er en tidsbestemt tilførsel av immunceller i hjernen som er drevet ved aktivering av hjerne endotelceller, betydelig kjemokin-sekresjon og økt sympatisk utstrømning 1-3. Inflammatorisk celleinfiltrasjon ble tidligere ansett som skadelig i iskemisk slag, men flere behandlingsforsøk utviklet for å blokkere ukritisk leukocytt utgang til hjernen ikke klarte å indusere en målbar klinisk nytte 4. Flere nylig, ble det klart at moncyttavledede celler opprinnelig involvert i utviklingen av iskemisk skade 5 kan også spille en sentral rolle for oppløsning av betennelse og påfølgende vev reparasjon seks.
Takk til identifisering av fenotypiske og funksjonelleonal heterogenitet blant monocytter og makrofager, har kunnskap om betydningen av mononukleære fagocytter i utvikling og oppløsning av betennelse betydelig utvidet. I mus, kan sirkulerende monocytter klassifiseres i minst to funksjonelt distinkte undergrupper i henhold til deres overflate ekspresjon av lymfocytt antigen 6-kompleks (Ly-6C) 7. Mens Ly-6C høye'inflammatory monocytes' ble tydelig vist å være avgjørende for kontroll av bakterieinfeksjoner 8, deres rolle i sterile skade er mer kontroversielt. I iskemisk hjerneslag, selektiv ablasjon av CCR2 + Ly-6C høye monocytter resulterte i hemoragisk infarkt transformasjon 6. Men den samme eksperimentell tilnærming forbedret akutt uførhet etter intracerebral blødning 9. Likeledes er forskjellige undersett av T-celler antas å utøve enten skadelige 10 eller beskyttende virkninger 11 på iskemisk hjerneskade, er imidlertid data controversial 12,13 og warrants videre undersøkelser. Gitt denne økende kompleksitet, blir det klart at dypere kunnskap om rollene til de ulike immunceller i iskemisk skade og reparasjon er avgjørende for å oversette eksperimentelle funn i terapi rettet mot innlegget hjerneslag betennelse.
I dag, den mest kraftfulle verktøy for å analysere cellulære immunresponser er polykromatisk flowcytometri. Det tillater identifisering og kvantifisering av forskjellige immuncelleundergrupper på inflammasjonsstedet uten behov for å forspenne system ved in vivo merking eller genetisk manipulasjon 14. Samtidig farging av celleoverflatemarkører med antistoffer mot intracellulære cytokiner 15 eller transkripsjonsfaktorene 16 gir i tillegg informasjon om funksjonell tilstand av individuelle, fenotypisk identifisert celler. Som en stor ulempe, er enkeltcellesuspensjoner kreves for strømningscytometriske analyser og dermed informasjon om localization av cellulære infiltrater er tapt. Imidlertid, mens histologi gjør det enkelt å få romlig informasjon, blir det begrenset av antallet av antistoffer som kan anvendes ved en eneste gang for å karakterisere immuncelleundertyper i et bestemt vev. Dag, er en kombinasjon av nærvær og fravær av forskjellige overflatemarkører for å entydig identifisere sjeldne immuncelleundergrupper, spesielt de distinkte monocytt-avledede cellepopulasjoner i løpet av betennelse 17.
Her beskriver vi en effektiv protokoll for å isolere høyt antall leukocytter fra postischemic musehjerne ved hjelp av en enkel ett-lags tetthetsgradient. De oppnådde cellesuspensjoner kan enten analysert ved multi-dimensjonal flowcytometri eller ytterligere anrikes ved strømningscytometrisk sortering eller immunomagnetisk valg for å utføre svært spesifikke nedstrøms analyser. Metoden detaljer transcardial perfusjon, fjerning av hjernehalvdelene, dissosiasjon av hjernevev i én celle suspensions, tetthetsgradient-sentrifugering for fjerning myelin så vel som antistoff-farging for flowcytometrisk analyse.
Her beskriver vi en enkel og effektiv metode for isolering av leukocytter fra den murine hjernen etter eksperimentell slag. Tilnærmingen gir pålitelig svært reproduserbare celler per hjernen halvkule tillater å måle ulike strømnings paneler i en biologisk replikere.
Angivelig, vil en ufullstendig fjerning av blod inkludert immunceller resultere i et forvrengt syn på den faktiske mengden av betennelsesceller som kom inn i iskemisk hjernen. Så når du bruker denne protokollen være spesielt oppmerksom på grundig transcardial perfusjon for å hindre forurensning av infiltrerte immunceller med ikke-inflammatoriske sirkulerende leukocytter. Fra erfaring, reduserer bruken av sløve nåler for venstre hjertekammer punktering risikoen for skade av det interventrikulære septum som ville omgå perfusjon av den systemiske sirkulasjonen. Fremveksten av perfusjon væske fra neseborene er et tegn på at den perfusjon pressureis for høyt, og dermed envoid strømningshastigheter> 10 ml / min. Pale til hvite fargen på hjernevev indikerer god perfusjon mens rosa farge er et tegn på dårlig perfusjon.
Et annet kritisk punkt i denne protokollen er effektiv dissosiasjon av hjernevev som omfatter mekanisk fragmentering samt enzymatisk fordøyelse. Hakking vevet gjennom celle sil er kritisk for å tilveiebringe forbedret effektivitet av proteaser. Imidlertid, når homogenisering av vevet, unngå for stort trykk som mononukleære fagocytter er svært utsatt for autolyse 22. For enzymatisk fordøyelse Liberase TL er anbefalt som er en blanding av høyt renset kollagenase I og II som inneholder lave konsentrasjoner av den nøytrale proteasen termolysin. Den direkte sammenligning med tidligere beskrevne isolasjon protokoller 14,22,23 avslørte betydelig høyere utvinning av levedyktige celler ved Liberase TL behandling (KM upubliserte data). Sammenlignet med kollagenase som er bruker ofted for isolering av immunceller fra hjernen, inneholder Liberase TL neglisjerbare nivåer av endotoksin. Dette er av spesiell betydning hvis celler sorteres for genetisk analyse, fordi høye nivåer av endotoksin kan endres av aktiveringstilstanden av immunceller 24 og alvorlig svekke cellekultur utfall 25. En annen ulempe ved tradisjonelle kollagenase er betydelige masse-til-mange forskjeller i de enzymaktiviteter som truer reproduserbarhet av resultater og krever bestemmelse av arbeidskonsentrasjon for hvert parti 26.
I den voksne hjernen, myelin fjerning av densitetsgradientsentrifugering er en uunnværlig skritt for nedstrøms applikasjoner som flowcytometri eller videre studier på gen eller protein uttrykk. En stor fordel med den protokoll er et enkelt-lags tetthet fremgangsmåte som ikke krever tidkrevende fremstilling av gradienter. Videre er separasjonen protokollen produserer pålitelig resultats selv når utført av ganske uerfarne forskere. Det er blottet for lagdelte gradienter med tettheter nær hverandre som er vanskelige å pipette uten å forstyrre grensesnittet i mellom.
Basert på ekspresjon av CD45 overflatemarkør, protokollen gir celle tre hovedkategorier i den ischemiske hjerne. De aller fleste av celler tilhører en CD45 negative befolkning som er sammensatt av nerveceller, astroglia, ependymal og endotelceller. Deres rikelig tilstedeværelse er knyttet til densitetsgradient med ett lag som i hovedsak tar sikte på effektiv myelin og avfall fjernes. I tillegg kan en CD45 int befolkning representerer bosatt microglia 27 skilles fra en CD45 høy befolkning som hovedsakelig inneholder infiltrere hematogene leukocytter. Imidlertid bør det bemerkes at aktiverte mikroglia kan fastsette fenotype og funksjonen av blod-fødte myeloide celler. Dermed er det bare å bruke sophisticated teknikker som parabiosis 28, hjernespinn benmarg 29 eller skjebne kartlegging analyse 30 tillate en klar distinksjon mellom de to bestandene ved betennelse.
Analyse av data i flowcytometri er ofte begrenset til den prosentvise fordeling av spesifikke cellepopulasjoner. Men når du sammenligner infarktet halvkule til ikke-infarkt hjernevev denne informasjonen kan være misvisende fordi den ikke anser totalt hjerne leukocyttverdiene som er endret av iskemisk skade. Derfor, for å tegne et fullstendig bilde av omfanget og fenotype av inflammatoriske infiltrater etter hjerneslag relative fordelingen av immuncelle undergrupper bør suppleres med absolutte celle tall. Ved bruk av mikroperler som er beskrevet i denne protokollen, er pipettering av en nøyaktig prøvevolum helt obligatorisk for å oppnå pålitelige resultater. Videre er omvendt pipettering sterkt anbefalt å unngå skumdannelse i telle røret. Oppstår luftboblervil redusere forventet volum av mikroperler og dermed føre til en overvurdering av absolutte CD45 høy leukocyttverdiene i utvalget.
Oppsummert gir denne protokollen en enkel og pålitelig metode for å isolere immunceller fra hjernen. Det kan tjene som et verdifullt verktøy for å dissekere kompleksiteten av den inflammatoriske respons på hjerneinfarkt. Fremtidige anvendelser omfatter undersøkelser på den tidsavhengige rolle av monocytt delmengder i forplantning og oppløsning av iskemisk hjernebetennelse. Tilsvarende er rollen til det adaptive immunsystemet etter hjerneslag dårlig forstått. Flowcytometrisk analyse av T-celle subpopulasjoner identifisert av uttrykket av undergruppe spesifikke transkripsjonsfaktorer eller cytokiner in situ kan bidra til å avklare deres innvirkning på langsiktig bedring etter hjerneslag, og dermed åpne lovende veier for utvikling av nye behandlingsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Isabell Schulz for utmerket teknisk støtte.
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |