Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.
Ischemisk stroke initierar en robust inflammatoriskt svar som börjar i det intravaskulära rummet och involverar snabb aktivering av hjärnresidensceller. En viktig mekanism för denna inflammatoriska reaktion är migrationen av cirkulerande immunceller till den ischemiska hjärnan underlättas av kemokin frisättning och ökad endotel adhesionsmolekyl uttryck. Brain-invaderande leukocyter är välkända bidra till tidig sekundär ischemisk skada, men deras betydelse för terminering av inflammation och senare hjärn reparation har nyligen uppmärksammats.
Här, är ett enkelt protokoll för effektiv isolering av immunceller från den ischemiska mushjärna tillhandahålls. Efter transcardial perfusion, är hjärnhalvorna dissekeras och mekaniskt dissocierade. Enzymatisk spjälkning med Liberase följs av densitetsgradient (såsom Percoll) centrifugering för avlägsnande myelin och cellrester. En stor fördel med detta protokoll iär den enda lager densitetsgradient förfarande som inte kräver tidskrävande förberedelse av lutningar och tillförlitligt kan genomföras. Tillvägagångssättet ger mycket reproducerbara celltal per hjärnhalvan och gör det möjligt att mäta flera flödescytometri paneler i en biologisk replikera. Fenotypisk karakterisering och kvantifiering av hjärnan invaderande leukocyter efter experimentell stroke kan bidra till en bättre förståelse för deras mångfacetterade roller i ischemisk skada och reparation.
Cerebral stroke utlöser en fördröjd inflammatorisk respons som startar snabbt efter upphörande av den lokala blodflödet och involverar i stort sett alla delar av immunsystemet. Ett viktigt kännetecken för denna inflammatoriska respons är en tidsinställd inflöde av immunceller till hjärnan som drivs genom aktivering av hjärn endotelceller, väsentlig kemokin sekretion och ökad sympatisk utflöde 1-3. Inflammatorisk cellinfiltration har tidigare ansetts skadlig vid ischemisk stroke, dock flera behandlingsförsök utformade för att urskillningslöst blockera leukocyt- egress till hjärnan misslyckades med att inducera en mätbar klinisk nytta 4. På senare tid, blev det uppenbart att monocythärledda celler initialt involverade i utvecklingen av ischemisk skada 5 också kan spela en central roll för att lösa inflammation och efterföljande vävnadsreparation 6.
Tack vare identifieringen av fenotypiska och functiOnal heterogenitet bland monocyter och makrofager, har kunskapen om betydelsen av mononukleära fagocyter i utveckling och upplösning av inflammation betydligt. I möss, kan cirkulerande monocyter klassificeras i åtminstone två funktionellt distinkta underuppsättningar beroende på deras yta uttryck av lymfocytantigen 6-komplex (Ly-6C) 7. Medan Ly-6C höga'inflammatory monocytes' tydligt visat sig vara viktig för kontroll av bakterieinfektioner 8, är deras roll i steril skada mer kontroversiella. I ischemisk stroke, selektiv ablation av CCR2 + Ly-6C höga monocyter ledde hemorragisk infarkt transformation 6. Men samma experimentella tillvägagångssätt förbättrad akut funktionshinder efter intracerebral blödning 9. På liknande sätt är olika undergrupper av T-celler antas utöva antingen skadliga 10 eller skyddande åtgärder 11 i ischemisk hjärnskada, emellertid finns data controversial 12,13 och garanterar ytterligare undersökningar. Med tanke på detta ökande komplexitet, blir det tydligt att en djupare kunskap om roller de olika immunceller i ischemisk skada och reparation är avgörande för att översätta experimentella resultaten i terapier inriktade efter stroke inflammation.
Idag är den mest kraftfulla verktyg för att analysera cellulära immunsvar polychromatic flödescytometri. Den tillåter identifiering och kvantifiering av olika immuncellundergrupper vid inflammationsstället utan behov att förspänna systemet genom in vivo-märkning eller genetisk manipulering 14. Samtidig färgning av cellytemarkörer med antikroppar mot intracellulära cytokiner 15 eller transkriptionsfaktorer 16 dessutom ger information om funktionstillstånd av enskilda, fenotypiskt identifierade celler. Som en stor nackdel är enkelcellsuspensioner krävs för flödescytometriska analyser och därmed information om localization cellulära infiltrat går förlorad. Men medan histologi är idealisk för att få rumslig information är det begränsas av antalet av antikroppar som kan användas på en enda gång för att karakterisera immuncellundertyper i en viss vävnad. Idag, behövs en kombination av närvaro och frånvaro av olika ytmarkörer för att otvetydigt identifiera sällsynta immuncellundergrupper, i synnerhet de distinkta monocythärledda cellpopulationer under inflammation 17.
Här beskriver vi ett effektivt protokoll för att isolera ett stort antal leukocyter från postischemiska mushjärna med hjälp av en enkel single-layer densitetsgradient. De erhållna cellsuspensioner kan antingen analyseras genom flerdimensionell flödescytometri eller ytterligare berikas genom flödescytometrisk sortering eller immunomagnetisk val att utföra mycket specifika nedströms analyser. Metoden detaljer transcardial perfusion, avlägsnande av hjärnhalvorna, dissociation av hjärnvävnaden till en enda cell suspensioner, densitetsgradientcentrifugering för myelin borttagning liksom antikroppar färgning för flödescytometrisk analys.
Här beskriver vi en enkel och effektiv metod för isolering av leukocyter från den murina hjärnan efter experimentell stroke. Tillvägagångssättet ger ett tillförlitligt sätt mycket reproducerbara celltal per hjärnhalvan gör det möjligt att mäta olika flödespaneler i ett biologiskt replikera.
Uppenbarligen kommer en ofullständig borttagning av blod inklusive immunceller resultera i en förvrängd bild på den faktiska mängden av inflammatoriska celler som trädde den ischemiska hjärnan. Således, vid användning av detta protokoll ägna särskild uppmärksamhet åt noggrann transcardial perfusion för att förhindra kontaminering av infiltrerade immunceller med icke-inflammatoriska cirkulerande leukocyter. Av erfarenhet, minskar användningen av trubbiga nålar för vänster kammare punktering risken för skada kammarskiljeväggen som skulle kringgå perfusion av den systemiska cirkulationen. Uppkomsten av perfusionsfluid från näsborrarna är ett tecken på att perfusionen pressureis för hög, sålunda, envoid flödeshastigheter> 10 ml / min. Pale till vit färg på hjärnvävnad indikerar god perfusion medan rosa färg är ett tecken på dålig perfusion.
En annan avgörande steg i detta protokoll är effektiv dissociation av hjärnvävnad som innefattar mekanisk fragmentering samt enzymatisk spjälkning. Mals vävnaden genom cellen sil är kritisk för att åstadkomma förbättrad effektivitet av proteaser. Men när homogenisering vävnaden, undvika överdrivet tryck som mononukleära fagocyter är mycket mottagliga för autolys 22. För enzymatisk digerering Liberase TL rekommenderas som är en blandning av höggradigt renat kollagenas I och II, som innehåller låga koncentrationer av det neutrala proteaset termolysin. Den direkta jämförelse med tidigare beskrivna isoleringsprotokoll 14,22,23 avslöjade signifikant högre återställande av livskraftiga celler genom Liberase TL behandling (KM opublicerade data). Jämfört med kollagenas som ofta använderd för isolering av immunceller från hjärnan, Liberase TL innehåller försumbara nivåer av endotoxin. Detta är särskilt viktigt om celler sorteras för nedströms analys eftersom höga halter av endotoxin kan ändra aktiveringstillstånd av immunceller 24 och allvarligt försämra cellodling utfall 25. En annan nackdel med traditionella kollagenas är betydande parti till parti skillnader i enzymaktivitet som äventyrar reproducerbarhet av resultat och kräver bestämningen av arbetskoncentration för varje parti 26.
I den vuxna hjärnan, är myelin avlägsnas genom densitetsgradientcentrifugering ett nödvändigt steg för tillämpningar efter såsom flödescytometri eller fortsatta studier på gen eller proteinuttryck. En stor fördel med protokollet är densiteten förfarande enkelt lager som inte kräver tidskrävande beredning av gradienter. Dessutom producerar separationsprotokoll tillförlitligt resultatär även när de utförs av ganska oerfarna praktiker. Det saknar skiktade gradienter med densiteter som ligger nära en annan som är svåra att pipett utan att störa gränsytan däremellan.
Baserat på uttrycket av den ytmarkör CD45, ger protokollet tre huvudcellkategorierna i den ischemiska hjärnan. De allra flesta celler tillhör en CD45 negativ befolknings som består av nervceller, astroglia, ependymceller och endotelceller. Deras riklig förekomst tillskrivs den enda lager densitetsgradient som i första hand syftar till en effektiv myelin och avlägsnande av skräp. Dessutom kan en CD45 int population representerar bosatt mikroglia 27 skiljas från en CD45 hög befolkning som främst innehåller infiltrerande hematogena leukocyter. Emellertid bör det noteras att aktiverade mikroglia får anta fenotypen och funktionen av blodfödda myeloidceller. Således, bara tillämpa sophisticated tekniker såsom parabiosis 28, benmärg chimärer 29 eller ödet kartläggningsanalys 30 medger en tydlig åtskillnad mellan dessa två populationer under inflammation.
analys av data i flödescytometri är ofta begränsad till den procentuella fördelningen av specifika cellpopulationer. Men när man jämför infarkt halvklotet till icke-infarkthjärnvävnad denna information kan vara missvisande eftersom den inte anser totala hjärn leukocytantalet som ändras av ischemisk skada. Således, för att rita en fullständig bild på storleken och fenotypen av inflammatoriska infiltrat efter stroke relativa fördelningen av immuncellundergrupper bör kompletteras med absoluta cellantalen. Vid användning av mikropärlor som beskrivs i detta protokoll, är pipettering av en exakt provvolym absolut obligatoriskt att erhålla tillförlitliga resultat. Dessutom är omvänd pipettering rekommenderas för att undvika skumbildning i räkningsröret. Uppstår luftbubblorkommer att minska den förväntade volymen av mikropärlor och därmed leda till en överskattning av absoluta CD45 hög leukocyter i provet.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll en enkel och tillförlitlig metod för att isolera immunceller från hjärnan. Det kan tjäna som ett värdefullt verktyg för att dissekera komplexiteten i den inflammatoriska responsen på ischemisk stroke. Framtida tillämpningar inkluderar undersökningar på tidsberoende roll monocyt grupper i utbredning och upplösning av ischemisk hjärninflammation. På liknande sätt är den roll som det adaptiva immunsystemet efter stroke dåligt kända. Flödescytometrisk analys av T-cell subpopulationer identifierats av uttrycket av delmängd specifika transkriptionsfaktorer eller cytokiner på plats kan bidra till att klargöra deras inverkan på långsiktig återhämtning efter stroke och därmed öppna lovande vägar för utveckling av nya behandlingsmetoder.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Isabell Schulz för utmärkt teknisk support.
Peri-Star Pro Peristaltic Pump, 4-channel | World precision instruments | PERIPRO-4LS | |
Heracell 240i CO2 incubator | Thermo Scientific | ||
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmbH | ||
Heraeus Multifuge 3SR+ | Thermo Scientific | ||
FACS Canto II | Becton Dickinson | ||
Isoflurane | Abbott | 4831850 | |
Hank's buffered salt solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies GmbH | 14175-129 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco/Life Technologies GmbH | 24020-091 | |
Liberase TL | Roche Diagnostics GmbH | 5401020001 | use at room temperature |
Percoll Plus | GE Healthcare Europe GmbH | 17-5445-01 | |
Fetal bovine serum | PAN Biotech | 3302-P101003 | |
Trypan blue | Gibco/Life Technologies GmbH | 15250-061 | |
Trucount | BD Biosciences | 340334 | |
Phosphate buffered saline | Biochrom AG | L 182-10 | |
DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 11284932001 | |
CD11b Horizon V500 | BD Biosciences | 562128 | |
CD16/CD32 | eBioscience | 14-0161 | |
CD45.2 FITC | eBioscience | 11-0454 | |
CD3 PE | Biolegend | 100307 | |
CD19 PE-Cy7 | Biolegend | 115519 | |
Ly6C APC-Cy7 | BD Biosciences | 560596 | |
Ly6G PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560602 | |
Silicone Tubing, 1m | World precision instruments | 503022 | |
Fine Iris Scissors sharp | Fine Science Tools | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine Iris Scissors sharp/blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Straight 1×2 teeth forceps | Fine Science Tools | 11021-14 | |
Blunt-end Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | |
5ml syringe plunger | Carl Roth GmbH (Braun) | EP96.1 | |
Cell strainer, 100µm | Dr. I. Schubert, BD | 2360-00 | |
Omnican Fine dosage syringe 1ML | Braun | TBD | |
Cell strainer, 70µm | Greiner Bio-One GmbH | 542 070 | |
FACS Tubes | BD Bioscience GmbH | 352052 | |
serological pipettes, 10ml | Greiner Bio-One GmbH | 607180 | |
serological pipettes, 10ml | Sarstedt AG&Co | 861,254,025 | |
serological pipettes, 25ml | Greiner Bio-One GmbH | 760180 | |
serological pipettes, 5ml | Greiner Bio-One GmbH | 606180 | |
serological pipettes,25ml | Sarstedt AG&Co | 861,685,020 | |
serological pipettes,5ml | Sarstedt AG&Co | 861,253,025 | |
Tips, 0,1-10µl | Corning B.V.Life Sciences | 4840 | |
Tips, 100-1000µl | Greiner Bio-One GmbH | 740290 | |
Tips, 10-200µl | Greiner Bio-One GmbH | 739296 | |
Reaction tubes 1,5ml | Greiner Bio-One GmbH | 616201 | |
Reaction tubes 2ml | Greiner Bio-One GmbH | 623201 | |
Bacteriological petri dish, 94x16mm | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | |
Falcon 15ml | Greiner Bio-One GmbH | 188271 | |
Falcon 50ml | VWR International GmbH (BD) | 734-0448 | |
Neubauer hemocytometer | Biochrom AG | PDHC-N01 | |
razor blade | Carl Roth GmbH | CK07.1 |