Verwaltung und Nachweis von Protein-Kennzeichen auf Arthropoden für Dispersal Forschung
Summary
Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.
Abstract
Überwachung Arthropoden Bewegung ist oft erforderlich, um damit verbundenen Bevölkerungsdynamik, Verbreitungsmuster, Wirtspflanze Vorlieben, und andere ökologische Wechselwirkungen besser zu verstehen. Arthropoden sind in der Regel in der Natur durch Markieren sie mit einer einzigartigen Signatur verfolgt und dann neu zu sammeln sie über Zeit und Raum, um ihre Ausbreitung Fähigkeiten zu bestimmen. Neben der tatsächlichen physikalischen Tags, wie farbige Staub oder Farbe wurden verschiedene Arten von Proteinen sehr wirksam für die Kennzeichnung von Arthropoden für ökologische Forschung bewährt. Proteine können intern und / oder extern verabreicht werden. Die Proteine können dann wieder eingefangen Arthropoden mit einem Protein-spezifischen Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen werden. Hier beschreiben wir Protokolle für außen und innen Tagging Arthropoden mit Protein. Zwei einfache experimentellen Beispiele werden gezeigt: (1), um ein Insekt durch die Bereitstellung eines Protein-angereicherte Ernährung und (2) eine externe Protein Zeichen topisch a eingeführt eine interne Proteinzeichenum ein Insekt mit einem medizinischen Vernebler ngewandte. Wir beziehen dann eine Schritt-für-Schritt-Anleitung des Sandwich und indirekt verwendet werden, um Proteinmarkierungen auf den Insekten erkennen ELISA-Verfahren. In dieser Demonstration werden verschiedene Aspekte der Akquisition und den Nachweis von Protein-Marker auf Arthropoden für Mark-Release-Wiederfang, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Capture-Arten der Forschung diskutiert, zusammen mit den verschiedenen Möglichkeiten, die immunomarking Verfahren wurde angepasst ist, eine Vielzahl von Forschungszielen entsprechen.
Introduction
Verfolgen der Bewegung von tierischen Schädlingen, natürliche Feinde (Parasitoide und Raubtiere) und Bestäuber in der Natur ist für ein besseres Verständnis, wie man wesentliche Ökosystemdienstleistungen zu verbessern. Die Schlüsselkomponente für die meisten Arten von Ausbreitungs Forschung ist eine zuverlässige Methode, um die Arthropoden (en) von Interesse zu markieren. Eine Vielzahl von Materialien (zB Lacke, Farben, farbig Stäube, Tags, seltenen Elementen, Proteine) verwendet worden, um Arthropoden markieren, ihre Populationsdynamik, Ausbreitung Fähigkeiten zu beurteilen, Fütterung Verhalten und anderen ökologischen Interaktionen 1,2.
Die Zweckmäßigkeit einer Markierung für eine gegebene Ausbreitungs Forschung verwendet werden abhängig von der Art der Untersuchung, die durchgeführt werden. Es gibt drei große Kategorisierungen für die Kennzeichnung von Arthropoden: (1) Mark-Release-Wiederfang (MRR), (2) Mark-Erfassung, und (3) Eigenmarke-Capture. Für Mark-Release-Rückeroberung der Forschung, der Ermittler kennzeichnet typischerweise die Arthropoden kollektiv in der Laboratory und gibt sie an einer zentralen Stelle im Feld. Die Arthropoden werden dann auf verschiedenen räumlichen und zeitlichen Abständen unter Verwendung verschiedener Erfassungsgeräte (zB Sweep net, Vakuum, klebrigen Falle) 3,4,5 zurückerobert. Die zurückerobert Proben werden dann untersucht, für die spezifische Markierung von nativen Personen veröffentlicht zu unterscheiden. Für Mark-Capture-Forschung, gilt der Untersucher in der Regel die Markierung direkt im Feld mit Spritzgeräten (zB Rückenspritze, boom und Düsenspritze). Die besten Marker für die Mark-Capture-Forschung sind kostengünstig und einfach an den Arthropoden Lebensraum aufgebracht. Für Eigenmarke-Capture-Forschung, gilt der Untersucher in der Regel Noten zu einem Arthropoden Köder 6,7 oder Nesteingang 8. Im Gegenzug, die Arthropoden kennzeichnet sich intern durch verschlingt die markierte Köder oder extern durch "Bürsten" gegen die Marke, wie es das Nest verlässt.
Wie oben erwähnt, sind viele Arten von Markierungen uns gewesened, um eine Vielzahl von Arthropoden-Arten zu taggen. Aber nur sehr wenige sind nützlich für alle drei dieser Zerstreuung Forschungskategorien. Die Entwicklung des Proteins immunomarking Verfahren war ein großer Durchbruch zur Markierung Insekten. Immunomarking stellt ein Protein Etikett auf Arthropoden entweder intern oder extern, was wiederum, wird von einem Anti-Protein-spezifischen Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) nachgewiesen. Die erste derartige Protein-Marker verwendet wurden Kaninchen-Immunglobulin (IgG) und Huhn IgG / IgY 9,10. Sie erwiesen sich als sehr wirksam Markierungen für MRR und Selbst-Mark-Capture-Forschung (siehe Diskussion) sein. Leider sind die IgG / IgY Proteine kostspielig und daher nicht praktisch für die Mark-Capture-Forschung und die meisten Arten von Eigenmarke-Capture-Forschung. Anschließend wurden der zweiten Generation Proteinnachweis ELISAs für Proteine in Hühner Eiweiß (Albumin), Kuhmilch (Casein) und Soja-Milch (Trypsin-Inhibitor-Protein) enthalten entwickelt. Jeder Test ist sehr empfindlich, spezifisch und am meistenwichtiger ist, verwendet Proteinen, die viel weniger teuer als die IgG / IgY-Proteine sind 11. Diese Proteine wurden effektiv für MRR, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Capture-Forschung (siehe Diskussion) bewährt.
In diesem Artikel beschreiben wir, und zeigen, wie die Proteinmarkierung Labor Retention Studien durchzuführen. Solche Studien sind die erste Phase der Forschung für jede Art von Feldausbreitung Studie erforderlich. Genauer gesagt, ist es entscheidend, dass die Ermittler wissen, wie lange die Marke wird über die gezielten Arthropodenarten vor dem Einschiffen auf Feldausbreitungsstudien beibehalten werden. Hier beschreiben wir, und zeigen, wie man nach innen und außen zu markieren Insekten für MRR, Mark-Capture-und Selbst-Mark-Aufnahmeart Feldstudien. Wir haben uns dann zeigen, wie man die Anwesenheit der Markierungen mit indirekter und Sandwich ELISAs zu erkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Arthropoden Protein immunomarking Verfahren wurde erstmals vor einem Jahrhundert 9 beschrieben, fast ein Viertel. Seitdem hat sich das Verfahren so angepasst, dass die Verbreitungsmuster von einer Vielzahl von Arthropoden mit intern und extern verabreicht IgG / IgYs studieren. Diese Proteine wurden standhaft Marker für die große Vielzahl von bisher getesteten Insektenarten erwiesen. Wie oben erwähnt, ist die Haupteinschränkung für die Verwendung von IgG / IgYs ist jedoch, dass sie sehr teuer si…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung wurde von USDA CRIS 5347-22620-021-00D Verfügung gestellt und zum Teil von der Landwirtschaft und Nahrungsmittelforschung Initiative Competitive Grants-Nr. 2011-67009-30141 vom USDA National Institute of Food and Agriculture. Wir sind dankbar für die technische Unterstützung der Johanna Nassif. Wir danken auch Paul Baker, David Horton, Diego Nieto und Frances Sivakoff für die Bereitstellung einiger der in 3 verwendeten Bilder.
Materials
| Food storage container (for insect rearing) | Rubbermaid/Tupperware | Various sizes | Various manufacturers & vendors. Mesh fabric is glued in a window ` |
| Small volume nebulizer (Micro Mist) | Teleflex-Hudson RCI | 1881 | Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well. |
| Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap | Continental Lab Products | 4445.X | Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids. |
| Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5×20 grid) | RPI Corp. | 145746 | This design is nice because it doesn't crowd the tubes. |
| Dispenser, repeater | Eppendorf | 4982000322 | Anything similar will help speed up the dispensing. |
| Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 mL | Kimble Chase | 749521-1500 | Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse. |
| BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom) | BD | 351172 | |
| Ovation pipette, manual (20-200 µl) | VistaLab | 1057-0200 or 1070-0200 | Any similar type will work. This model is ergonomic. |
| Reservoirs, sterile reagent | VistaLab | 4054-1000 | Anything similar will work. |
| Electronic pipette, 8-channel (50-1200 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730391 | If you had to pick one electronic model, this size is most useful. |
| Electronic pipette, 8-channel (10-300 µl) (Biohit eLine) | Sartorius | 730361 | Anything similar will work. |
| Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight) | Sigma-Aldrich | Z369802 | Anything similar will work for manual plate washing. |
| Microplate reader with absorbance detection | Molecular Devices | SpectraMax 250 | Anything similar will work. |
| Chicken IgG/IgY | United States Biological | I1903-15R | Also available from other sources |
| Egg whites | Grocery store | “All Whites”, “Egg Beaters”, etc. | Mix 5 mL with 95 mL dH2O for 5% solution |
| Tris (Trizma Base) | Sigma-Aldrich | T1503 | 2.42 g/L to make TBS |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | 29.22 g/L to make TBS and 8.0 g/L for PBS |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S0876 | 1.14 g/L for PBS |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | 0.2 g/L for PBS |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | 0.2 g/L for PBS |
| Tween 20, EIA grade | Sigma-Aldrich | P1379 | Add 0.5 mL per L to PBS after salts are dissolved. |
| PBS with 1% BSA | Sigma-Aldrich | P3688 | Mix 1 packet in 1 L dH20 |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500) | Sigma-Aldrich | C6409 | Mix 100 µl in 50 ml TBS |
| Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%) | Grocery store | Mix 10 g with 1 L dH2O for 1% solution | |
| Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10000) | Sigma-Aldrich | A9046 | Mix 100 ul in 1 L of 1% milk |
| Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8000) | Sigma-Aldrich | C6534 | Dilute 125 µl in 1 L PBS-BSA |
| Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2000) | Sigma-Aldrich | A6154 | Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3 ml Silwet |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77)silicon-polyether copolymer | Lehle Seeds | VIS-01 | Add as last ingredient |
| TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate | SurModics | TMBW-1000-01 |
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