In Vivo cérébrale fonctionnelle approche d'imagerie à base de calcium Bioluminescent Indicateur GFP-aequorine
Summary
Nous présentons ici un roman Ca 2+ -Imagerie approche utilisant un journaliste bioluminescente. Cette approche utilise une construction GFP-aequorine condensé qui se lie au Ca 2+ et émet de la lumière, éliminant le besoin d'une lumière d'excitation. Significativement cette méthode permet à long imagerie continue, l'accès à des structures profondes du cerveau et une haute résolution temporelle.
Abstract
Fonctionnelle imagerie in vivo est devenu une approche puissante pour étudier la fonction et la physiologie des cellules et des structures d'intérêt cerveau. Récemment, une nouvelle méthode de Ca 2+ -Imagerie utilisant le journaliste bioluminescente GFP-aequorine (GA) a été développé. Cette nouvelle technique repose sur la fusion des gènes GFP et l'équorine, produisant une molécule capable de lier le calcium et – avec l'ajout de son coelentérazine cofacteur – émettant une lumière vive qui peut être contrôlé par un collecteur de photons. Les lignées transgéniques portant le gène de la GFP-aequorine ont été générés pour les souris et la drosophile. Chez la drosophile, le gène GFP-aequorine a été placé sous le contrôle du système d'expression binaire GAL4 / UAS permet une expression ciblée et de l'imagerie à l'intérieur du cerveau. Cette méthode a été démontré par la suite pour être capable de détecter à la fois vers l'intérieur de Ca2 + et Ca2 + -transients -released dans les magasins internes. Et surtout, il permet une plus grande durée de l'enregistrement en continu, l'imagerie à plus grande profondeur dans le cerveau, et l'enregistrement à des résolutions temporelles élevées (jusqu'à 8,3 msec). Ici, nous présentons la méthode de base pour l'utilisation de l'imagerie bioluminescente pour enregistrer et analyser Ca 2+ -Activité dans les corps pédonculés, une structure centrale à l'apprentissage et la mémoire dans le cerveau de la mouche.
Introduction
La structuration et la fonction de l'activité dans le cerveau et ses structures discrètes fondamentale ont longtemps été un domaine d'étude intense dans le domaine des neurosciences. Peut-être que certaines des premières approches utilisées avec succès pour traiter cette question étaient mesure physiologique directe de la modification de l'activité électrique – méthodes cependant alternatives qui permettent l'imagerie en direct des changements dans les concentrations tension, pH ou de calcium (comme proxy pour l'activité) ont apporté des capacités supplémentaires à l'étude de l'activité neuronale 1. Les techniques d'imagerie comportent une large gamme d'avantages tels que l'invasivité et réduit la capacité de surveiller l'activité à l'intérieur de structures cérébrales entières. En outre, dans les animaux avec la génétique dociles dont la mouche drosophile, le développement d'indicateurs de calcium codés génétiquement, tels que Cameleon GCaMPs et autres 1 ont permis aux chercheurs de surveiller les neurones simples, populations neuronales et le cerveau entierstructures. Bien que plusieurs méthodes d'imagerie de calcium fluorescentes traditionnelles utilisant GCaMPs (GFP fusionnée à la calmoduline) ou FRET (CFP et YFP fusionnée à la calmoduline) se sont révélés être des techniques utiles offrant une bonne résolution spatiale et temporelle, le processus sous-jacent de la lumière d'excitation engendre quelques limitations sur sa expérimentale applications. En raison de la nature de la lumière d'excitation, autofluorescence, photo-blanchiment, la phototoxicité et sont inévitablement produite, ce qui limite en conséquence la profondeur des structures qui peuvent être imagés, la durée des enregistrements ainsi que la continuité de temps réel de l'enregistrement. En d'autres termes, les enregistrements doivent souvent être effectuées de façon intermittente pour éviter ces effets secondaires indésirables.
En raison de ces défis, nouvelles méthodes de rechange imagerie calcique ont été développés. Une des méthodes les plus prometteuses est l'imagerie bioluminescente, qui repose sur la lumière produite par une réaction enzymatique après liaison calcium. Bioluminescent imagerie ne nécessite pas de lumière d'excitation et par conséquent ne pas éprouver les mêmes difficultés que l'imagerie calcique conventionnelle. Le journaliste bioluminescente Aequorin – isolé de Aequorea victoria, même Jellyfish à partir de laquelle la GFP a été isolated- aussi se lie au calcium par l'intermédiaire de ses trois structures de main EF et subit un changement de conformation, conduisant à l'oxydation de sa coelentérazine cofacteur et la libération de la lumière bleue (λ = 469 nm) 2,3. Aequorine a une très faible affinité pour le calcium (K d = 10 uM) ce qui le rend idéal pour la surveillance transitoires calciques parce qu'il produit très peu de bruit de fond et ne pas interférer avec le système tampon de calcium intracellulaire 4. Bien que l'aequorine a déjà été utilisé pour surveiller le processus d'induction neurale dans l'œuf Xenopus 5 de la lumière produite est trop faible à utiliser pour l'imagerie en temps réel de l'activité neuronale. Dans un effort pour relever ce défi, Philippe Br &# 251; laisser et ses collègues de l'Institut Pasteur créé une construction génétique fusion GFP et l'équorine gènes, imitant l'état natif dans le méduses 4. Ce produit de gène de fusion se lie au calcium de nouveau par l'intermédiaire des trois structures de la main EF de l'aequorine, qui subit un changement de conformation qui conduit à l'oxydation de la coelentérazine, qui transfère l'énergie non radiatif à la GFP. Ce transfert d'énergie entraîne la libération de la lumière verte (λ = 509 nm) de la GFP, la place de la lumière bleue de l'aequorine. La fusion de la GFP et l'équorine confère également une plus grande stabilité de la protéine aider le produisent de la lumière de la protéine de fusion de 19 à 65 fois plus brillante que l'équorine seule 4. En utilisant une approche bioluminescent dans le cerveau augmente l'application expérimentale courant de l'imagerie de calcium en termes de la durée d'enregistrement continu et le nombre de structures dans le cerveau qui peuvent être enregistrées. Large dans le contexte des travaux antérieurs, cela signifie que la fois globale et une plus grandevariété de «activité» régionalisée du cerveau peut être surveillé (par le proxy des transitoires de calcium). Plus important encore l'activité peut être surveillée pendant plus longtemps, dans un temps réel et de manière continue, ce qui se prête facilement à la poursuite d'une compréhension complète de la fonction basale dans le cerveau.
Au cours des dernières années, notre laboratoire et d'autres ont développé des mouches transgéniques exprimant la GFP-aequorine sous le contrôle du système d'expression binaire (GAL4 / UAS-GFP-aequorine) 5,6. Nous avons utilisé la GFP-aequorine bioluminescence à l'activité d'enregistrement produite par des stimuli naturels tels que le parfum 7,8, ainsi que les composants cellulaires étudiés modulation Ca 2+ -Activité dans les corps pédonculés suivantes acétylcholine stimulation du récepteur nicotinique par l'application directe 9. En outre, nous avons également utilisé GFP-aequorine pour répondre à un certain nombre de questions expérimentales qui ont pas pu être abordées précédemment, comme à long termeImagerie de transitoires calciques spontanées et la visualisation des structures plus profondes du cerveau 10. Plus récemment, nous avons utilisé le système / UAS GAL4 pour exprimer le récepteur de mammifère ATP P2X 2 11 un canal de cation, dans les neurones de projection (PNS) et utilisé le système LexA pour exprimer GFP-aequorine dans les corps pédonculés (MB247-LexA, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (une gracieuseté de B. Pfeiffer, Janelia Ferme, États-Unis). Cela nous a permis d'activer les unités de raccordement par l'application de l'ATP, qui active à son tour les corps pédonculés (une cible en aval de la SNP), imitant des conditions plus naturelles, comme la réponse à un stimulus d'odeur. Globalement, cette technique combinant P2X 2 et GFP-aequorine élargit les possibilités expérimentales. Globalement, il offre la possibilité de mieux comprendre les tendances de l'activité dans le cerveau, engager de nouvelles études sur la manière dont différents stimuli et des perturbations peuvent modifier la structuration de l'activité basale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'approche de la GFP-aequorine basé bioluminescent-développé récemment présenté ici permet in vivo enregistrement fonctionnel de Ca2 * -Activité à différents neurones, ainsi que le cas échéant, dans d'autres types de cellules telles que des cellules de rein étoilées tel que rapporté dans Cabrero et al. 2013 5.
Modifications, tir ennuis, des composants supplémentaires, et les étapes critiques
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
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