Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em> Arabidopsis</em> Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
Die Pflanzenzellwand ist eine dynamische Struktur. Wachsende Zellen werden durch eine primäre Zellwand umgeben ist, zu erweitern die Organisation, der ermöglicht Zellen. Zellen, die Kaution zu wachsen, um eine steifere Sekundärwand aufhören, die die mechanische Unterstützung der Anlage verbessert. Beide Zellwände bestehen aus Cellulose – Mikrofibrillen zusammengesetzt in einer Matrix aus Polysacchariden verschiedener Strukturen eingebettet (beispielsweise Hemicellulose und Pektin), die über die verschiedenen Entwicklungsstadien variieren und Geweben 1,2. Cellulose wird synthetisiert, wie Ketten (1,4) -β-D-Glucan, die eng ausgerichtet sind, die Mikrofibrillen einer kristallinen Struktur zu bilden. Amorpher Cellulose bezieht sich auf die Regionen, in denen die Glucan-Ketten weniger geordnet. Das Verhältnis zwischen dem kristallinen und dem amorphen Domänen ist ein Parameter gedacht , um die mechanischen Eigenschaften der Zellwand beeinflussen, durch die mechanische Festigkeit und viskoelastische Eigenschaft Bereitstellen bzw. 3. Verschiedene Verfahren wurdenentwickelt , um die zwei Formen von Cellulose Anordnung zu detektieren und zu quantifizieren, darunter Röntgenbeugung und Kreuzpolarisation / Magic Angle NMR Solid-State – Spinnen 4. Röntgenbeugung kann verwendet werden , um den Anteil an kristallinen gegenüber amorpher Cellulose Domänen in der Probe 5 zu bestimmen. Eine alternative Methode verwendet Fraktionierung von Zellwand-Gehalt in säureunlösliche und säurelösliches Material, zwischen dem kristallinen und amorphen Cellulose oder anderen Polymeren zu unterscheiden, respectively. Bei diesem Ansatz Einbau markierter Glukose ([14 C] Glucose) wird verwendet , um die Cellulose 6,7 zu quantifizieren. Diese Verfahren erfordern große Mengen von Pflanzenmaterial für ganze Organ Analysen allenfalls und daher sind unzureichend empfindlich auf gewebespezifische Variation in der Zellwandstruktur. Visualisierung von Zellulosemikrofibrillen auf zellulärer Auflösung kann in Live – Imaging – Studien mit Fluoreszenzfarbstoffen 8,9 kombiniert erreicht werden, dass Änderungen erkennen können,die Orientierung der Cellulosemikrofasern. Jedoch werden diese Farbstoffe nicht zur Quantifizierung verwendet, sie sind nicht spezifisch Cellulose kristallin und kann mit der normalen Struktur der Zellwand 8 stören. PolScope ist ein bildgebendes Verfahren , das auf der Fähigkeit von kristalliner Cellulose beruht Lichtstrahlen zu teilen und einen Teil des Lichts 10 zu verzögern. Licht Retardierung ist am stärksten für Mikrofibrillen, die senkrecht zur Richtung der Lichtausbreitung liegen. Für Mikrofibrillen mit ähnlicher Orientierung, desto höher ist der Grad der Kristallinität ist , desto größer der Lichtverzögerung 11. Daher wird PolScope verwendet zu untersuchen, sowohl die relativen Niveaus und der Orientierung der Cellulosemikrofasern.
Wurzeln aufweisen lineares Wachstum, bei der Zellen an der Stammzellnische Ursprung an der Spitze der Wurzel, durchlaufen eine Reihe von Zellteilungen, bevor sie schnell 12 erweitern. Die Zellen, die das Wurzel erweitern in einer unidirektionalen (anisotroper)Art und Weise, wie durch kleine Molekül Signalisierungs Hormone diktiert, die die Eigenschaften der Zellwand 13 auswirken. Differential Reaktionen auf Hormone, in Zeit und Raum, ein Mittel zur Gewährleistung einer ausgewogenen Organwachstum 14. Daher können hochauflösende Analyse der Zellwandstruktur wichtige Informationen, die notwendig sind, um besser die Verbindung zwischen Zelltyp-spezifische Antworten auf ganze Organwachstum zu verstehen. Hier berichten wir über die Umsetzung der PolScope gewebespezifische Anreicherung von kristalliner Cellulose in Arabidopsis Wurzeln zu untersuchen, wie es in hoher Qualität anatomischen Abschnitten beobachtet. Dieses Verfahren kürzlich zelltypspezifischen Anhäufung von kristalliner Cellulose in Reaktion auf räumliche Störung der hormonellen Aktivität 15 freigelegt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von kristalliner Cellulose in den verschiedenen Geweben , die Arabidopsis Wurzeln Komponieren, während anatomische Information erhalten bleibt. Als solches bietet es einen zusätzlichen Schritt in Richtung Wachstum zu verstehen Prozesse in Pflanzen auf zellulärer Auflösung. Dieses Verfahren kann auch für die Untersuchung der zusätzlichen Pflanzenarten und Organe angewendet werden.
Eine Reihe von Punkten berücksicht…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
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