Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em> Arabidopsis</em> Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações
Summary
Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.
Abstract
Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.
Introduction
A parede de célula de planta é uma estrutura dinâmica. células em crescimento são cercadas por uma parede celular primária, cuja organização permite que as células a se expandir. As células que param de crescer depósito de uma parede secundário mais rígido que reforça o suporte mecânico da planta. Ambas as paredes celulares são compostas de microfibrilas de celulose embebidas numa matriz de polissacáridos de estruturas diferentes (por exemplo, hemicelulose e pectina) que variam entre o estágio de desenvolvimento diferentes e tecidos 1,2. A celulose é sintetizada na forma de cadeias de (1,4) -β-D-glucano que são fortemente alinhados para formar a micro fibrilas de uma estrutura cristalina. celulose amorfa refere-se às regiões onde as cadeias de glucano são menos ordenada. A relação entre o cristalino e os domínios amorfos é um parâmetro pensado para afectar as propriedades mecânicas da parede da célula, fornecendo resistência mecânica e característica viscoelástica, respectivamente 3. Vários métodos têm sidodesenvolvidas para detectar e quantificar as duas formas de arranjo de celulose, entre eles de difracção de raios-X e polarização cruzada / ângulo mágico girando RMN de estado sólido 4. Difracção de raios-X pode ser utilizada para determinar a proporção de cristalino contra domínios celulose amorfa na amostra 5. Um método alternativo usa fraccionamento de parede celular conteúdo em material insolúvel em ácido e solúvel em ácido, para distinguir entre a cristalina e a celulose amorfa, ou outros polímeros, respectivamente. Nesta abordagem, a incorporação de glicose marcada ([14 C] glucose) é utilizada para quantificar a 6,7 de celulose. Estes métodos necessitam de grandes volumes de material de planta para análises de órgãos inteiros, na melhor das hipóteses, e, portanto, são inadequadamente sensível à variação específica do tecido na estrutura da parede celular. A visualização das microfibrilas de celulose com uma resolução celular pode ser obtida em estudos de imagem ao vivo combinados com corantes fluorescentes 8,9, que podem identificar mudanças naa orientação das microfibrilas de celulose. No entanto, estes corantes não são utilizados para quantificação, eles não são específicos de celulose cristalina e pode interferir com a estrutura normal da parede celular 8. Polscope é uma técnica de imagiologia que se baseia na capacidade de celulose cristalina para dividir os feixes de luz e retardar a parte da luz 10. retardo de luz é mais forte para as microfibrilas que se situam perpendicularmente à direcção da propagação da luz. Para microfibrilas com orientação semelhante, quanto maior o grau de cristalinidade, quanto maior for o retardamento de luz 11. Assim, polscope é utilizado para estudar ambos os níveis relativos e orientação das microfibrilas de celulose.
Raízes exibem crescimento linear, durante o qual as células originárias no nicho de células-tronco, na ponta da raiz, são submetidos a uma série de divisões celulares, antes de se expandir rapidamente 12. As células compreendendo a raiz expandir numa unidireccional (anisotrópica)forma, como ditado por pequenos hormônios molécula de sinalização que impactam as propriedades da parede celular 13. Respostas diferenciadas aos hormônios, no tempo e no espaço, fornecer um meio de garantir o crescimento de órgãos equilibrada 14. Assim, a análise de alta resolução da estrutura da parede celular podem fornecer informações importantes necessários para melhor compreender a relação entre as respostas específicas do tipo de células para crescimento de órgão inteiro. Aqui, nós relatamos a implementação de polscope para estudar a acumulação específica de tecido de celulose cristalina em raízes de Arabidopsis, como observado em seções anatômicas alta qualidade. Este método recentemente descoberto de acumulação específico do tipo de célula de celulose cristalina, em resposta à perturbação espacial da actividade hormonal 15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um método para determinação do acúmulo de celulose cristalina em diferentes tecidos que compõem as raízes de Arabidopsis, mantendo informações anatômicas. Como tal, ela fornece uma etapa adicional para a compreensão de processos de crescimento em plantas com uma resolução celular. Este método pode também ser aplicado para o estudo de espécies de plantas adicionais e órgãos.
Um número de pontos devem ser considerados quando se aplica o método. Em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).
Materials
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
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