उपन्यास मेट्रिक्स निमेटोड के भ्रूण बढ़ाव विशेषताएँ<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
अपने छोटे से जीवन चक्र: लगभग 50 वर्षों के लिए विकास, तंत्रिका जीव विज्ञान, विकास, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत, आदि में महत्वपूर्ण प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल के रूप में खुद को स्थापित निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस 1 विकास के अध्ययन में इस मॉडल की शक्ति में निहित है 3 दिन के; कितनी आसानी से इन पशुओं को आनुवंशिक रूप से परिवर्तित किया जा सकता है; इसकी पारदर्शिता कि रहने वाले जानवरों और इसके विकास ज्यादातर अतिरिक्त गर्भाशय है कि सेल में विस्थापन और आकृति विज्ञान के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है। निमेटोड के विकास के चरणों embryogenesis और चार लार्वा चरणों (L4 को एल 1), वयस्कता के द्वारा पीछा शामिल है। भ्रूण विकास के दौरान, एपिडर्मल morphogenesis कैसे उपकला कोशिकाओं एक समूह है, कैसे वे अपने जंक्शनों पुनर्निर्माण के रूप में पलायन का एक बेहतर समझ प्रदान करने और उनके व्यक्तिगत आकृति विज्ञान के साथ ही एक कार्यात्मक उपकला भीतर उनके रिश्तेदार स्थिति को संशोधित करने की क्षमता के लिए काफी ध्यान आकर्षित किया।एपिडर्मल morphogenesis चार चरणों में बांटा गया है: पृष्ठीय पृष्ठीय epidermal कोशिकाओं के पुनर्गठन में मिलकर मध्यनिवेश, हाइपोडर्मिस के रूप में भेजा; उदर बाड़े, उदर midline इस प्रकार एक उपकला सेल monolayer में भ्रूण encasing की ओर उदर hypodermal कोशिकाओं के प्रवास में मिलकर; जल्दी और देर बढ़ाव कीड़ा के रूप लार्वा में सेम के आकार भ्रूण बदलने। बाद morphogenesis, भ्रूण हैच और एल 1 लार्वा उनके तत्काल वातावरण में उपलब्ध बैक्टीरिया का उपयोग खिला शुरू करते हैं।
भ्रूण बढ़ाव इसलिए भ्रूण के विकास के लिए एक देर चरण है। यह अपनी अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ भ्रूण के विस्तार और इसके अनुप्रस्थ व्यास की कमी के होते हैं। इस hypodermal कोशिकाओं के आकार का एक नाटकीय संशोधन शामिल है। बढ़ाव एक जल्दी और देर चरण में बांटा गया है। प्रारंभिक चरण अल्पविराम स्तर पर शुरू होता है और समाप्त होता है जब शरीर दीवार की मांसपेशियों w में 1.75 गुना के स्तर पर करार शुरूआईएलडी प्रकार (डब्ल्यूटी) भ्रूण – भ्रूण है कि गैर-लम्बी भ्रूण की तुलना में लंबाई में 1.75 गुना कर रहे हैं करने के लिए इसी। Morphogenic प्रक्रियाओं है कि मंच पर होने वाली मुख्य रूप से filamentous actin बंडलों (एफबीएस) hypodermal कोशिकाओं के शिखर ध्रुव पर स्थित है कि भ्रूण 2 की Antero पीछे अक्ष के साथ उनकी बढ़ाव ड्राइव के संकुचन द्वारा संचालित कर रहे हैं। FBS के संकुचन तीन kinases लश्कर-502 / रॉक, MRCK -1 और पाक-1 5 से मायोसिन- प्रकाश चेन के फोस्फोराइलेशन द्वारा नियंत्रण है। बढ़ाव की देर चरण शुरू होता है, जब शरीर दीवार की मांसपेशियों कार्यात्मक हो जाते हैं और करार शुरू करते हैं। यह पृष्ठीय और उदर hypodermal कोशिकाओं को शरीर दीवार की मांसपेशियों से mechanotransduction संकेतन शामिल है और समाप्त होता है जब जानवरों पक्षियों के बच्चे 3।
और उन एल 1 लार्वा (लारवल गिरफ्तारी phenotype के रूप में उनके विकास को गिरफ्तार करने; बढ़ाव दोष आम तौर पर भ्रूण के रूप में मरने पशुओं का प्रतिशत (EMB भ्रूण मारक); की विशेषता है एल.वी.क) और गुम्मट की तुलना में काफी कम किया जा रहा। विकासात्मक गिरफ्तारी के मंच की पहचान मृत भ्रूण का सूक्ष्म अवलोकन की आवश्यकता है और लार्वा 3-6 गिरफ्तार कर लिया।
हाल ही में यह दिखाया गया था कि इस तरह के Cdc42 / आरएसी नियामक और प्रेरक PIX -1 और पाक-1, के रूप में कई जीन, दोनों जल्दी और देर बढ़ाव 3,7 दौरान morphogenic प्रक्रियाओं को नियंत्रित। हम यह भी हाल ही में पता चला है कि morphogenic प्रक्रियाओं जल्दी बढ़ाव 3 से 7 के दौरान भ्रूण के Antero पीछे अक्ष के साथ भिन्न होते हैं। इन निष्कर्षों उपन्यास मेट्रिक्स विशेष रूप से जल्दी या देर से बढ़ाव चरणों और अन्य मैट्रिक्स जल्दी बढ़ाव के दौरान उनके Antero पीछे अक्ष के साथ भ्रूण की आकृति विज्ञान के लक्षण वर्णन के लिए सक्षम करने को निशाना बनाने का विकास प्रेरित किया।
ये उपन्यास तरीकों उनकी की चौड़ाई के साथ ही शुरुआत में जल्दी और बढ़ाव के अंत में भ्रूण की लंबाई मापने में मिलकर बनता है वहविज्ञापन और पूंछ। 7 दो प्रोटोकॉल भी नव रची लार्वा की लंबाई, एल 1 चरण 7 पर सिंक्रनाइज़ को मापने के लिए विकसित किए गए।
भ्रूण की अनावश्यक कार्य क्षारीय हाइपोक्लोराइट उपचार के खिलाफ उनकी रक्षा करते हुए लार्वा, वयस्कों और संस्कृति मीडिया में मौजूद बैक्टीरिया उपचार से भंग कर रहे हैं। इस इलाज तो एक गैर सिंक्रनाइज़ आबादी अच्छी तरह से खिलाया वयस्कों 8 के बहुमत से युक्त से भ्रूण को शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है। खाद्य प्रतिबंध नव रची लार्वा सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। मापने इन लार्वा की लंबाई तो बढ़ाव दोष का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह माप संस्कृति प्लेटों पर गिरफ्तार किया गया लार्वा की माप से अधिक पसंद है क्योंकि लार्वा कि पक्षियों के बच्चे से पूरी तरह से गैर-लम्बी भ्रूण जब खिला "सामान्य लंबाई" के लिए ठीक हो सकता है लेकिन जब भोजन के अभाव में गिरफ्तार उनके कम आकार को बनाए रखने जाएगा।
यहाँ, हम le की माप को सक्षम करने विस्तृत प्रोटोकॉल पेशभ्रूण के साथ ही उनके सिर की चौड़ाई और पूंछ समय चूक डीआईसी माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण (1 प्रोटोकॉल) का उपयोग elongating के ngth। हम यह भी सिंक्रनाइज़ लार्वा छवि विश्लेषण (प्रोटोकॉल 2) और प्रवाह Cytometry (प्रोटोकॉल 3) का उपयोग करने की लंबाई को मापने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल जल्दी को चिह्नित करने के उपन्यास मैट्रिक्स और भ्रूण बढ़ाव की देर चरणों का वर्णन है।
धारा 1 में महत्वपूर्ण कदम पैड पर बैक्टीरिया की संभावित उपस्थिति है। भ्रूण भली भांति बंद करक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
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