En Detección de la cara del óxido nítrico y superóxido en la capa endotelial de las arterias intactas
Summary
En este artículo se describe un método relativamente fácil adaptarse usando el colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE) para la detección simultánea en face y visualización de óxido nítrico intracelular (NO) y el anión superóxido (O 2 .- ), respectivamente, en las aortas recién aisladas intactos de un modelo de obesidad ratón.
Abstract
óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir del endotelio NO-sintasa (eNOS) es una de las moléculas vasoprotective más importantes en la fisiología cardiovascular. Disfuncional eNOS como desacoplamiento de eNOS conduce a la disminución en la biodisponibilidad de NO y el aumento de anión superóxido (O 2 .-) de producción, y a su vez promueve las enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, la medición apropiada de NO y O 2 .- niveles en las células endoteliales son fundamentales para la investigación sobre las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO y O 2 .-, es difícil medir el NO y O 2 .- directamente en un vaso sanguíneo. Numerosos métodos se han desarrollado para medir el NO y O 2 .- producción. Es, sin embargo, ya sea insensible, o no específicas, o técnicamente exigente y requiere un equipo especial. A continuación se describe una adaptacióndel método de colorante de fluorescencia para la detección simultánea en face y visualización de intracelular NO y O 2 .- utilizando la celda permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) y dihydroethidium (DHE), respectivamente, en aortas intactos de un modelo de obesidad inducida ratón por la alimentación alta en grasas de la dieta. Hemos podido demostrar una disminución intracelular NO y O 2 .- mejorado los niveles en las aortas intactas recién aisladas de ratón de la obesidad, en comparación con el ratón magra control. Se demuestra que este método es una técnica fácil para la detección directa y la visualización de NO y O 2 .- en los vasos sanguíneos intactos y se puede aplicar ampliamente para la investigación de la función endotelial (dys) en (fisio) condiciones patológicas.
Introduction
Las células endoteliales vasculares mantienen la integridad funcional y estructural vascular por la liberación de factores vasoactivos 1. Entre estos factores, el óxido nítrico derivado del endotelio (NO) producido a partir de L-arginina a través endotelial NO-sintasa (eNOS) es el factor más importante y mejor caracterizado en la fisiología cardiovascular 2. NO causa la relajación del músculo liso e inhibe la proliferación celular, inhibe la agregación plaquetaria y la adhesión celular y la infiltración inflamatoria en el espacio subendotelial, por lo tanto, la protección contra el desarrollo de enfermedad vascular 3. Bajo muchas condiciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el envejecimiento, la hipertensión, la diabetes, la hiperlipidemia, etc., la disfunción endotelial se caracteriza por disminución de la biodisponibilidad de NO y el aumento de O 2 .- producción está presente y promueve la patogénesis de la aterosclerosis 2. Los estudios realizados en los últimos años demuestran que el desacoplamiento de la eNOS es unamecanismo importante para la disfunción endotelial, en la que la enzima eNOS genera O 2 .- en lugar de NO, bajo las diversas condiciones antes mencionadas 1,4. Por lo tanto, el análisis de la función endotelial, en particular, la producción de NO endotelial y O 2 .- generación es fundamental para la investigación experimental en las enfermedades cardiovasculares y las complicaciones.
Hay numerosos enfoques metodológicos que se han desarrollado para analizar y medir la producción de NO en muestras biológicas. Debido a la naturaleza extremadamente lábil de NO que se oxida fácilmente en NO 2 – y NO 3 – con una vida media de 3 a 6 segundos, es difícil de medir directamente NO. Por lo tanto la determinación de NO 2 – / NO 3 – en las muestras de fluido se utiliza como un índice de NO liberado de las células o tejidos 5. Aunque el procedimiento es relativamente fácil, el método es, sin embargo, easily afectados por el alto fondo del NO estable 2 – / NO 3 – contenida en la solución. Debido a que no estimula la guanilato ciclasa soluble para producir monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) 6, el nivel de GMPc celular también se ha determinado para estimar la liberación de NO 7. Una vez más, esta es una estimación indirecta y puede no ser específica, ya que algunos factores derivados del endotelio como-péptido natriurético tipo C (CNP) también podrían aumentar los niveles de GMPc a través de la activación de la guanilato ciclasa particulada 8. El NO es producido a partir de L-arginina con generación de L-citrulina como se utiliza por lo tanto también subproducto 9, la medición de la producción de L-citrulina como un método indirecto para estimar la producción de NO. Los principales inconvenientes de este método son que es radiactivo y no mide los niveles de NO bioactivos, ya que libera NO podría ser inactiva rápidamente por O 2 .-; Por otra parte, L-citrulina puede ser reciclado a L-arginina 10. Otros métodos químicos, tales como la detección de quimioluminiscencia 11, la resonancia de spin electrónico 12, o porfirínico electroquímica NO sensor 13 son utilizadas por varios investigadores. Estos métodos no son generalmente fáciles de funcionamiento, procedimientos de detección y requieren equipo especial. También es de mencionar que muchos estudios se aplican experimentos baño de órganos con vasos sanguíneos aislados con o sin el endotelio para evaluar la función endotelial y indirectamente medir relajaciones NO vascular mediada derivados del endotelio. Sin embargo, este método, aunque es en su mayoría cerca de situación fisiológica, pero estrictamente decir, no mide NO función, en lugar evalúa respuestas vasomotoras mediada por el endotelio en general que reflejan efectos netos de la función eNOS, la producción de otro relajante derivado del endotelio factores y factores contratantes derivados del endotelio, la producción de O 2 .-, y también las respuestas de las células del músculo lisoa estos factores. Un análisis específico de la función eNOS o la producción de NO por lo general se requiere 3.
Muchos grupos de investigación, incluyendo la nuestra tienen en los últimos años utilizan el método de tintura fluorescente para detectar la producción intracelular de NO 14-19. En este método se utilizó la célula indicador de fluorescencia permeable diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) para medir la función libre de NO y NOS en células y tejidos in vitro o ex vivo vivo. El principio es que en las células vivas, DAF-2DA se desacetila por esterasa intracelular a no fluorescente de 4,5-diaminofluorescein (DAF-2) que después se convierte en fluorescente DAF-2 triazol (DAF-2T) por reacción con NO . La fluorescencia de DAF-2T se puede observar bajo un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal de fluorescencia 14. Por tanto, la intensidad de la fluorescencia intracelular refleja la producción de NO intracelular en las células o el endotelio de un vesse en sangre intactal. En combinación con un colorante de fluorescencia específica tal como dihydroethidium (DHE), se puede evaluar simultáneamente intracelular NO y O 2 .- generación en las células o en los vasos sanguíneos 14. Del mismo modo, DHE es también un compuesto permeable a las células que se oxida por O 2 .- dentro de las células, y el producto oxidativo a continuación, se intercala con ácidos nucleicos para emitir un color rojo brillante detectable cuantitativamente mediante microscopio de fluorescencia o fluorescencia microscopio confocal. DHE es un colorante muy específico para la detección de O 2 .- partir de muestras biológicas, ya que detecta esencialmente radicales superóxido, se conserva bien por las células, e incluso puede tolerar fijación suave 20. Una de las ventajas de este método de tinte de fluorescencia es que detecta y visualiza NO y / o O 2 .- en face directamente sobre la capa endotelial intacta de un vaso sanguíneo de estar.
En este papel,describimos este método colorante fluorescente para detectar el NO y O 2 .- que hemos adaptado para la detección de rostros es de NO y O 2 .- en aortas intactos de un modelo de ratón de la obesidad inducida por el alto contenido de grasa-dieta de alimentación (HFD). Se demuestra que este método podría con éxito y de forma fiable de medir el NO y O 2 .- niveles y evaluar la función eNOS (dis) en la capa endotelial de las aortas recién aislados intactos de ratón en la obesidad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detección de NO o O 2 .- con tintes fluorescentes se utiliza con frecuencia en muchos estudios en cultivos de células endoteliales y también en criosecciones de tejido 23. Aquí hemos extendido este método a los vasos sanguíneos de vida intacta, es decir, en la detección de rostros de NO y O 2 .- niveles en la capa endotelial con DAF-2DA y DHE, respectivamente, que sea eficaz, relativamente simple y intuitiva. En comparación con el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Swiss National Science Foundation (310030_141070/1), Swiss Heart Foundation, and National Center of Competence in Research (NCCR-Kidney.CH) Switzerland. Yu Yi is supported by the Chinese Scholarship Council.
Materials
| Dihydroethidium (DHE) | Invitrogen | D 1168 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock, stored at -20°C |
| Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2 DA) | Calbiochem | 251505 | dissolve with DMSO to 5 mmol/L as 1000X stock,stored at -20°C |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D 1306 | dissolve with water to 300 µmol/L as 1000X stock,stored at 4°C |
| Mounting medium | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| L-Name (N o-nitro-l-argininemethylester.HCl) | Sigma-aldrich | A5751 | |
| Pentobarbital | Sigma-aldrich | P3636 | |
| Multi-Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| Microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Leica | DM6000 | |
| Image processing software | National Institute of Health(NIH) | Image J | |
| Surgical scissors | S&T AG | SDC-11 | |
| Microsurgical scissors | F.S.T | 15000-01 | |
| Forceps | S&T AG | JF-5 | |
| 26G×1/2ʺ syringe | Becton Dickinson | 305501 | |
| Coverslip round diam15mm | vwr | 631-1579 | |
| Tips 1 mL | vwr | RFL-1200c | |
| Tips 200 uL | vwr | 613.0659 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-aldrich | A-6625 |
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