जाग व्यवहार मकाक बंदर कोर्टेक्स में सूचना प्रोसेसिंग की neuropharmacology जांच के लिए एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली
Summary
Here, we show the pressure injection of neuropharmacological substances during single-cell recording in an awake, behaving macaque monkey. This procedure allows pharmacological manipulation in the direct vicinity of a cortical recording site.
Abstract
The top-down modulation of feed-forward cortical information processing is functionally important for many cognitive processes, including the modulation of sensory information processing by attention. However, little is known about which neurotransmitter systems are involved in such modulations. A practical way to address this question is to combine single-cell recording with local and temporary neuropharmacological manipulation in a suitable animal model. Here we demonstrate a technique combining acute single-cell recordings with the injection of neuropharmacological agents in the direct vicinity of the recording electrode. The video shows the preparation of the pressure injection/recording system, including preparation of the substance to be injected. We show a rhesus monkey performing a visual attention task and the procedure of single-unit recording with block-wise pharmacological manipulations.
Introduction
In cortical and subcortical areas, neuronal activity is affected by various neuromodulators, for example acetylcholine1. These modulatory effects on neuronal responses have been reported in in vitro studies2, as well as in electrophysiological recordings from anesthetized animals3 and systemic pharmacological manipulations in humans4. Nevertheless, the exact role of different neuromodulators and the involvement of various receptor subtypes are largely unknown. To measure the effects of specific neuromodulators on the activity of single neurons, it is desirable to induce a temporary neuromodulator change as close as possible to the recording electrode. Furthermore, it is important that those manipulations are done in awake animals, as cognitive functions are only present in the absence of anesthesia. Additionally, anesthesia interacts with cholinergic and GABAergic systems5,6 and can lead to changes in neural activity3.
Within the last decades, two main methods of local drug delivery have been developed and refined: iontophoresis and pressure injection. In both methods drugs are delivered through micropipettes made of either glass or steel. With iontophoresis, an electrical current regulates the release of the drug7. Additionally, there is a significant contribution of electro-osmosis to the total amount of ejected molecules8, correlating with the tip diameter9 of the micropipette as well as with the concentration8 of the substance used. Iontophoresis is a powerful tool to quickly and precisely manipulate small volumes of nervous tissue. For iontophoretic injections, multi-barrel micropipettes are usually used10, with one acting as a recording device while the other positions serve as delivery pipettes. A limitation of this method is that only charged molecules can be used, severely limiting the selection of drugs.
Pressure injection uses either air compression or mechanical pressure to eject a substance from a micropipette. Using this method any soluble substance, charged or uncharged, can be used, including large molecules. The method of pressure injection was first described by Reyniers in 1933 and further refined in the 1950s (see Lalley11 for a review). In the 1980s the method was further refined to allow delivery of amounts in the nanoliter range (mainly lidocain12) to a defined brain area13 while simultaneously performing single-cell recording. The ejected volume was usually monitored by observing the movement of a marker, such as the meniscus in the upper part of the pipette13. Pressure injection was first used in the 1990s in awake animals, both extracellularly14 and intracellularly15,16. Based on the cumulative expertise gained in these studies it is now possible to reliably record from different brain structures in combination with pharmacological manipulation (see17 for a comparison of recent pressure injection systems).
An enduring open issue for both drug delivery methods is the difficulty in determining the precise volume injected. This is an even bigger challenge for experiments with awake, behaving rhesus monkeys where the animal performs the experimental task in a separate room. This can be alleviated by the use of a software-controlled system instead of relying on a visual marker to continuously monitor an injection.
The system described here is an extension of a well-established electrophysiological recording system (Mini Matrix System) and combines an injection pipette with multiple parallel-oriented recording electrodes at defined distances in a customizable arrangement. Pharmacological manipulation of the tissue near the recording electrode is possible using only a small amount of substance, ensuring a fast recovery and allowing multiple blocks of injection and control/recovery within the limited time window offered by the behavioral task of the animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम विस्तार से बताया है कि कैसे एक "मुस्तैद" दबाव इंजेक्शन सिस्टम के साथ विश्वसनीय और सटीक इंजेक्शन और उच्च गुणवत्ता वाले एक सेल रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए। दवा वितरण की इस पद्धति पहले से बंदरों (17 में समीक्षा) से बर्ताव में इस्तेमाल किया गया है, यहाँ प्रस्तुत प्रणाली लाभ, नीचे की समीक्षा की है।
जैसा कि चित्र में सचित्र -4 ए, यहाँ वर्णित प्रणाली के साथ और रिकॉर्डिंग साइट के आसपास के क्षेत्र में प्रत्यक्ष औषधीय इंजेक्शन के बिना एक न्यूरॉन गतिविधि के स्थिर माप प्रदान कर सकते हैं। जैसा कि चित्र 4 बी में दिखाया गया है, एक नियंत्रण पदार्थ, खारा के इंजेक्शन, दर फायरिंग में एक परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था। यह नियंत्रण दर्शाता है कि इंजेक्शन प्रक्रिया में ही दर्ज न्यूरॉन्स की फायरिंग संपत्तियों पर कोई औसत दर्जे का प्रभाव है।
न्यूरॉन, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, और micropipette के स्थानिक विन्यास महत्वपूर्ण है की इन प्रयोगों में महत्व। हालांकि रिकॉर्डिंग के दौरान ऊतकों में उनके रिश्तेदार पदों की एक सटीक माप संभव नहीं है, हम समझते हैं और विचरण के संभावित स्रोतों के लिए नियंत्रण कर सकते हैं। सबसे पहले, मात्रा इंजेक्शन के दौरान वहाँ एक जोखिम है कि ब्याज की न्यूरॉन रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से दूर विस्थापित किया जा सकता है, दर्ज संकेतों की स्थिरता प्रभावित हो रहा है। कारण है कि यह पहले और संकेत स्थिरता को सत्यापित करने के लिए इंजेक्शन ब्लॉक के बाद फायरिंग दर की तुलना करने के लिए समझदारी है। दूसरा, रिकॉर्डिंग प्रणाली की गाइड ट्यूब विन्यास इलेक्ट्रोड और micropipette के बीच की दूरी को परिभाषित करता है (जैसे।, गाढ़ा 3-चैनल प्रणाली में 305 माइक्रोन इस प्रयोग में इस्तेमाल किया)। प्रणाली इलेक्ट्रोड और ऊतकों में micropipette की गहराई के लिए सटीक स्थिति नियंत्रण प्रदान करता है, उनके बीच की दूरी को ध्यान से रिकॉर्डिंग (3.5 चरण) से पहले रिश्तेदार गहराई औजार, और रिकॉर्डिंग के दौरान एक आम गहराई में उन्हें रखने के द्वारा कम किया जा सकता है।
ईएनटी "> संभावित सीमाएंनिर्माता द्वारा घर में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए इसके अलावा, सिस्टम प्रयोगशाला की शर्तों के तहत मान्य किया जा करने के लिए, ट्यूब के विभिन्न ब्रांडों के रूप में की जरूरत है, सीरिंज आदि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अलग हो खंडों में अंतर करने के लिए ले जा सकता है। हालांकि प्रणाली प्रयोग में यहाँ दिखाया गया के रूप में बहुत छोटी मात्रा इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन न्यूनतम मात्रा है कि एक सामान्य प्रयोगशाला वातावरण में व्यावहारिक माप सीमाओं के कारण मान्य किया जा सकता से नीचे हैं। हालांकि, बड़े इंजेक्शन की मात्रा सॉफ्टवेयर परिभाषित मात्रा और मात्रा हार्डवेयर से निकली बीच संबंध अनुमान किया जा सकता है। पारदर्शी ट्यूबों का इस्तेमाल कर रहे हैं, इंजेक्शन प्रक्रिया का एक अतिरिक्त दृश्य की जांच के लिए एक दृश्य मार्कर के विस्थापन को मापने के द्वारा संभव है।
के रूप में micropipette के व्यास से थोड़ा बड़ा है और सामग्री और अधिक नाजुक है प्रणाली में micropipette डालने, इलेक्ट्रोड प्रविष्टि की तुलना में अधिक मांग है। इसके साथ – साथ,micropipette के पिन करने के लिए ट्यूब में शामिल होने को चुनौती देने के रूप में यह micropipette के ऊपरी भाग को तोड़ने के एक उच्च जोखिम जरूरत पर जोर देता है। हालांकि, एक सफलतापूर्वक लोड micropipette के जीवनकाल में कई महीनों, यहां तक कि दैनिक उपयोग के साथ है।
अभ्यास में, हम अभी तक सिस्टम की सफाई के बाद रिकॉर्डिंग के दौरान इंजेक्शन प्रणाली में एक रुकावट का सामना नहीं किया। फिर भी, कोई "ऑनलाइन" की जांच संभव है, और वहाँ एक जोखिम है कि एक भौतिक रुकावट (जैसे micropipette नोक पर ऊतक के रूप में) पदार्थ इंजेक्शन को रोकने सकता है। इसलिए यह इस तरह के आगे के विश्लेषण में केवल उन कोशिकाओं है कि प्रयोग के नियंत्रण और इंजेक्शन ब्लॉकों के बीच फायरिंग दरों में महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाने के रूप में शामिल, परंपरागत ढंग से डेटा का विश्लेषण करने के लिए उचित हो सकता है।
उनके छोटे व्यास के बावजूद, microelectrodes और pipettes मस्तिष्क के ऊतकों विस्थापित होंगे और कुछ स्थानीय ऊतकों को नुकसान का कारण बन सकता है। इस मैन्युअल वीं की नोक स्थिति से कम किया जा सकताई गाइड ट्यूबों सिर्फ ड्यूरा मेटर ऊपर। इलेक्ट्रोड तो ड्यूरा घुसना और उनके intactness उनकी impedances ऑनलाइन मापने के द्वारा अनुमान लगाया जाता है। बाद में, micropipette डाला जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग कर, ड्यूरा ऊपर ऊतक का नियमित रूप से हटाने के आगे इलेक्ट्रोड या पिपेट टूटने के जोखिम को कम करने के लिए सिफारिश की है।
वैकल्पिक तरीकों की तुलना
यहां इस्तेमाल किया प्रणाली अन्य दबाव इंजेक्शन प्रणाली की तुलना में स्पष्ट लाभ से पता चलता है। एक मजबूत लाभ micropipette (लगभग 100 माइक्रोन) है, जो अन्य उपलब्ध जांच 17 के आधे आकार है का व्यास है और इसलिए तंत्रिका ऊतकों को नुकसान को कम करता है। पिछले डिजाइन के विपरीत, मौजूदा प्रणाली स्थानिक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और micropipette अलग काम करते हैं। हालांकि अन्य प्रणालियों इलेक्ट्रोड और पिपेट के बीच एक छोटी दूरी प्रदान करते हैं प्रणाली यहाँ वर्णित इलेक्ट्रोड और पिपेट, इस प्रकार permi के स्वतंत्र गहराई में परिवर्तन की अनुमति देता हैएक रिकॉर्डिंग सत्र के भीतर चर रिश्तेदार दूरी tting। महत्वपूर्ण बात, कोई रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता के संबंध में समझौते के रूप में इंजेक्शन प्रणाली की स्थापना की एक रिकॉर्डिंग डिवाइस का एक विस्तार है, किए जाने की जरूरत है। केवल एक micropipette और इस प्रकार एक पदार्थ इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, यह एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया के भीतर कई पदार्थों इंजेक्षन करने के लिए संभव है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, कई micropipettes अलग गाइड ट्यूबों में पिरोया और अलग-अलग इंजेक्शन पंप में मुहिम शुरू की सीरिंज से जुड़ा जा सकता है। अंत में, प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए आसान है, के रूप में केवल एक कंप्यूटर प्रोग्राम इलेक्ट्रोड और micropipette अग्रिम करने के लिए, और प्रयोग के दौरान दबाव इंजेक्शन प्रदर्शन करने की जरूरत है।
योणोगिनेसिस करने के लिए दबाव इंजेक्शन की तुलना में, वहाँ रिश्तेदार फायदे और नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, दबाव इंजेक्शन अधिक से अधिक मात्रा, योणोगिनेसिस से ऊतक में पेश होने के लिए इस प्रकार न्यूरोनल विस्थापन का खतरा बढ़ आवश्यकता है। वर्तमान आद्यकर्नल नाथन रेंज में मात्रा में प्रयोग किया जाता है, और हम शायद ही कभी एक दर्ज सेल के संकेत गुणवत्ता में उल्लेखनीय परिवर्तन का अनुभव किया। इस प्रणाली को भी अनुमति देता बड़ी मात्रा में इंजेक्शन जा, जो व्यवहार जोड़तोड़ के लिए संभावित रूप से उपयोगी है, लेकिन न्यूरोनल रिकॉर्डिंग की स्थिरता को प्रभावित कर सकता है। योणोगिनेसिस पर दबाव इंजेक्शन की एक स्पष्ट लाभ के रूप में वहाँ का आरोप लगाया पदार्थों का उपयोग करने की कोई आवश्यकता नहीं है useable पदार्थों की बड़ी विविधता है। हालांकि, पीएच मान जाँच की जानी चाहिए और प्रयोगात्मक और नियंत्रण पदार्थों के बीच तुलना में (जैसे।, खारा)।
सवाल पैदा हो सकता है क्यों तंत्रिका गतिविधि से छेड़छाड़ के लिए इस तरह के optogenetics के रूप में नए तकनीक के बजाय दबाव इंजेक्शन की लंबे समय से स्थापित विधि का उपयोग करने के लिए। हालांकि अच्छी तरह से कृन्तकों में स्थापित, optogenetics अभी तक मज़बूती से रीसस बंदरों में स्थापित नहीं है। विशेष रूप से, यह अभी तक एक विशेष प्रकार के लिए न्यूरोट्रांसमीटर चयनात्मक कोशिकाओं के स्थानीय हेरफेर की अनुमति नहीं है। लंबी दौड़ में, हम देखते हैंसंज्ञानात्मक कार्यों के तंत्रिका आधार elucidating में optogentic जोड़तोड़ के फायदे के साथ औषधीय जोड़तोड़ के फायदे के संयोजन के लिए काफी संभावना।
यहाँ हम दिखाया है कि कैसे दबाव इंजेक्शन रीसस बंदरों बर्ताव, औषधीय जाग के दिमाग में एक स्थानीय स्तर पर प्रतिबंधित क्षेत्र में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमें उम्मीद है कि इस विधि के अन्य वैज्ञानिकों को प्रेरित करती है neuronal गतिविधि की गतिशीलता के लिए neuromodulatory योगदान की जांच करने के लिए।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र 889 "सेलुलर तंत्र संवेदी प्रसंस्करण के" अनुसूचित जनजाति के लिए (परियोजना C04) के माध्यम से ड्यूश Forschungsgemeinschaft का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। हम, जर्मन प्राइमेट सेंटर, डॉ Katharina Debowski और अन्ना Magerhans के स्टेम सेल यूनिट में सिना Plümer, Leonore Burchardt, डिर्क Prüsse, क्लाउस हेइसिग और तकनीकी और पशु से संबंधित समर्थन के लिए राल्फ Brockhausen और हमारे सहयोगियों को धन्यवाद में तकनीकी सहायता के लिए निस्पंदन प्रक्रिया।
Materials
| (-)-Scopolamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 55-16-3 | Mr 339.81 g/mol |
| NaCl 0.9% | B. Braun Melsungen AG | 3079870 | 5ml |
| Terg-a-zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | enzyme detergen |
| Hydrogen peroxide | Roth | Used in 3% solution with deionized water | |
| Ethanol | Chemie-Vertieb Hannover | 104642 | 70% |
| Deionized water | |||
| Injekt 40 Duo | B. Braun Melsungen AG | 9166432V | Syringe and needle |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes, amber | Eppendorf | 0030 120.191 | 1,5ml |
| Quarzglass micropipette | Thomas Recording | ||
| Recording electrode | Thomas Recording | quartz/platinum-tungsten fiber electrode; impedance value 1-2 MΩ and 0.3-0.5 MΩ | |
| PharmedBPT-Schlauch | Saint-Gobain Performance Plastics | 3702003 | Size: 0,25 x 2,05 mm (Wd: 0,9mm) |
| Loctite 401 | Henkel | 233641 | Superglue |
| Silicon oil | Thomas Recording | M-1000 | |
| Minisart RC15 | Sartorius | 17761———-R | Syringe filter |
| Multichannel Micro Injection System | Thomas Recording | multichannel microelectrode manipulator “System Eckhorn” equipped with microelectrodes and micropipettes and a precision multichannel microinjection pump | |
| McLab | custom | internal lab software to control stimulus presentation |
References
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