Количественный Glycomics и протеомикс Комбинированная стратегия очистки

Summary

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Abstract

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate ¹⁸O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

Introduction

В области протеомики, фильтр автоматизированного подготовки проб (ФАСП) получила широкое распространение благодаря своей способности минимизировать количество исходного материала, уменьшения артефактов подготовки проб, и максимизировать пропускную ^1. Тем не менее, такой способ еще появляться и получить тягу для области glycomics. Развитие высокой пропускной способности , количественные рабочие процессы необходимы из-за интегральной роли гликозилирования в биологической защиты и его модуляции рака или заболеваний ^2,3. У млекопитающих, N -glycans состоят из повторяющихся сахаридных единиц (гексозы (Hex), гексозамины (HexNac), сиаловой кислоты (NeuAc) и fucoses (ОФП)), украшающие основную структуру (Hex ₃ HexNac ₂₎ ⁴ ковалентно связанного на аспарагин. Хотя glycospace значительно большим , когда изомеры подсчитываются (> 10 ^12), она достаточно мала по композиции основы и молекулярные массы , как правило , в диапазоне от 1,000-8,000 Da ^{5 <}/ SUP>. Композиционное гомогенность класса и гидрофильность гликанах создают уникальные проблемы для очистки, разделения и масс – спектрометрии (МС) рабочих процессов ^6.

Традиционно N -glycans перевариваются из белков или пептидов пептидные N -glycosidase F (F PNG – азой) , а затем обогащается лектин аффинной хроматографии ^7, захваченный гидразида бисером ^8, или очищают с помощью твердофазной экстракции (SPE) ^9,10. Хотя эти методы все очень эффективны, они вводят дополнительные шаги для обессоливания и ограничить количество образцов одновременно обрабатывается. За последнее десятилетие, было предложено ряд высокопроизводительных платформ для glycomics. Ким и др. Опубликовали полуавтоматическим методом с использованием вакуумных, SPE 96-луночного планшета ^11. В качестве альтернативы, способ аффинно фильтр (N -glyco-ФАСП) была разработана группой Манн, которая требует первоначального модифицирования фифильтр с составным лектинов ^12. И, наконец, группа Томаса-Оутс предложил полуколичественного метод, фильтр Aided N -Glycan разделения (клыки), который эксплуатировал узкий Размерный состав glycospace ^13. Опираясь на молекулярный вес пороговым фильтром, мелкие загрязняющие вещества были сначала моют в отходы , а затем N -glycans переваривают и элюируют. Дегликозилированного белки остаются на фильтре в этом протоколе и могут быть подвергнуты в линии ФАСП.

Идентификация и количественное определение гликанов электрораспылением ионизации (ESI) MS требует офф-лайн для разделения (частичного) разрешения изомеров и дериватизации для обнаружения низких преобладающих видов. Этикетировочное в индивидуальности при нормализации стратегии гликановые теги гидразид дает совместимость с обращенной фазой жидкостной хроматографии (RPLC) ^14,15. 4-фенэтил-benzohydrazide (P2PGN) гидрофобные тег посредничает гидрофильность гликанах, ENHancing ионизацию, в среднем, в четыре раза ^16. Хотя другие методы, такие как permethylation ¹⁷ или амин-реактивным мечения биохимический ^18, содержат аналогичные преимущества, в гидразида реакции, гликаны реагируют 1: 1 стехиометрически в легковесных условиях. Относительное количественное определение достигается путем тандемного анализа образцов , дериватизированных с нативным (NAT) или ¹³ C ₆ изотопных меток стабильной (SIL).

Следующий метод развивается КЛЫКИ для плазменных приложений и пар его к гидрофобным тег P2GPN для точного относительного количественного определения. Кроме того, он был разработан, чтобы выполнить дробовика протеомики, дезамидирования профилирование и количественные glycomics на одной аликвоте образца, не ставя под угрозу целостность анализа.

Protocol

1. Белок и гликопротеин Денатурация и Алкилирование Для стандартных препаратов, нагрузки 2,5 мкл 0,1 мкг / мкл раствора гликопротеина (например , фетуина или РНКазы B) на 30 кДа или 10 кДа молекулярной массой (MW) отсечение фильтра. Для биологических образцов плазмы, проверять концентрацию белка с помощью анализа 20 (BCA) белка стандартного Брэдфорд 19 или бицинхониновой кислоты. Развести плазму, при необходимости, с помощью 100 мМ бикарбоната аммония (NH 4 HCO 3) в H 2 O (PNG – азой Digest буфер) при рН ~ 7 ​​содержит от 10-100 мг / мл общего белка. Нагрузка 2,5 мкл в плазме (25-250 мкг белка) на фильтр. Примечание: Этот протокол был протестирован только на плазме из образцов крови, собранных в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Добавляют 2 мкл 1 М раствора дитиотрептол (DTT) для каждой выборки в фильтре. Разведите образец с 200 мкл буфера PNG-азой переваривать. Закрывают трубку образца фильтр и слегка вихрь, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить фильтр из гнезда. Инкубируйте образца при 56 ° С в течение 30 мин, чтобы денатурировать белки и гликопротеины. Алкилировать образцы, добавить 50 мкл 1 М иодацетамида, чтобы получить конечную концентрацию ~ 200 мМ, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 60 мин. Примечание: Если анализ протеомика не требуется, шаг 1,5 может быть пропущен. Концентрат денатурированный гликопротеин на фильтре путем центрифугирования образцов при 14000 х г в течение 40 мин. Откажитесь течь через. 2. N -связанной Glycan ферментативного переваривания Вымойте образца с 100 мкл буфера PNG-азой переваривать. Концентрат гликопротеин на фильтре при 14000 х г в течение 20 мин и отбрасывать поток через. Повторите для стирки и концентрата шаг в два раза, в общей сложности три раза, получая концентрат в фильтре мертвого объема (~ 5 мкл). Выбросьте всепротекать. Отбросить коллекция флакон один раз моет завершены. Соберите все будущие элюентов и промывные в новый флакон коллекции. Примечание: PNG – азой переваривать буфер в H 2 18 O могут быть использованы во время стадии переваривания F для PNG – азой стабильных изотопов маркировки аспарагина сайтов де-гликозилированного, которые становятся химически Деамидированная. Добавьте 2 мкл глицерина, свободных от F PNG-азой (75000 х единиц / мл) для фильтрации после переноса в пробирку для сбора свежей. Добавьте 98 мкл буфера PNG-азой переваривания, в результате чего общий объем до 100 мкл, и осторожно пипеткой вверх и вниз на фильтре, чтобы перемешать. Ферментативно переваривать гликанов в условиях с шагом 2.2.1, 2.2.2, ИЛИ 2.2.3. Примечание: Три методы дегликозилированием белков могут быть использованы. Для анализа исключительно glycomics (без протеомики), рекомендуется длительный инкубационный на этапе 2.2.1. Для glycomics и протеомики исследований, шаги 2.2.2 и 2.2.3 будет производить продукцию высокого качества пептиды с минимальным не-зрecific деамидирование. Glycomics только для переваривания протокола (18hr): Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 18 ч до ферментативно расщеплять все N -glycans. Спайк в протоколе пищеварения (SPI): Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение 2 ч. Работая быстро, удалить образцы и шип в дополнительном 2 мкл глицерина свободной PNG-азой F (75000 х единиц / мл). Слегка вихрь образцов в течение 1-2 сек для смешивания. Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение еще 2 ч. Протокол СВЧ пищеварения (MD): Место образцов в микроцентрифужных трубки плавающей стойки. Образцы парить в 1 л лабораторный стакан заливается 1 л деионизованной (ДИ) воды. Стакан помещают в центре микроволновой печи (950 Вт) с вращающейся пластиной. Микроволновая печь при 60% мощности (570 Вт) в течение 5 мин. Для того, чтобы охладить, извлечь образцы и держать при комнатной температуре в течение 2 мин. Затем микроволновой печи в течение еще 5 мин при 60% -ной мощности. Примечание: настройки мощности СВЧ должны быть скорректированы на основе максимальной выходной мощности микроволновой печи.Средняя мощность должна поддерживаться постоянной между моделями. 3. Вымывание N -glycans Элюции гликаны центрифугированием образца при 14000 х г в течение 20 мин при температуре 20 ° С. Добавьте 100 мкл буфера PNG-азой переваривать к фильтру и центрифуге при 14000 х г в течение 20 мин при температуре 20 ° С. Собрать мыть содержащий все оставшиеся N -связанной Гликан, в том же флаконе коллекции в качестве элюента. Повторите дважды. Удалить фильтр и место в новом флаконе коллекции. Инкубируйте гликанов образцов в -80 ° C морозильнике до замороженного (30-60 мин). Высыхание до завершения, при комнатной температуре, в вакуумной концентратором (4-6 ч). Примечание: N -glycans можно хранить при температуре -20 ° С в течение до шести месяцев до дериватизации. 4. Белок ФАСП Переваривание Примечание: Если протеомика или анализ деамидирование сайта не требуется, раздел 4 протокола может быть пропущен. Полоскание тон фильтр, содержащий Деамидированная пептиды, с 400 мкл буфера 8 М мочевины. Пробирки закрывают крышками для сбора и слегка перемешать вихрь. Сконцентрируйтесь на фильтре при 14000 мкг в течение 15 мин. Выбросьте все проточные. Повторите шаг 4.1 еще два раза, в общей сложности три буферных мочевины стирок. Промыть фильтр, содержащий Деамидированная пептиды, с 400 мкл 2 М мочевины, 10 мМ CaCl 2 – буфера (трипсин переваривать буфер). Пробирки закрывают крышками для сбора и слегка перемешать вихрь. Сконцентрируйтесь на фильтре при 14000 мкг в течение 15 мин. Выбросьте все проточные. Повторите шаг 4.1 еще два раза, в общей сложности три трипсина переварить буфера стирок. Отбросить коллекция флакон один раз моет завершены. Соберите все будущие элюентов и промывные в новый флакон коллекции. Добавляют 50 мкл свиную модифицированного трипсина в 1:50 или 1: 5 трипсин: белок (вес / вес) отношение для обнаружения или количественного протеомики экспериментов, соответственно.Пробирки закрывают крышками для сбора и слегка перемешать вихрь. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 2 часов. Работая быстро, удалить образцы и шип в дополнительные 50 мкл трипсина в 1:50 или 1: белка: трипсин 5. Слегка вихрь образцов в течение 1-2 сек для смешивания. Инкубируйте образцы при 50 ° С в течение еще 2 ч. Элюируйте пептиды центрифугированием при 14000 мкг в течение 15 мин. Полоскание оставшиеся пептиды из фильтра с 400 мкл 1% -ной муравьиной кислоты и 0,001% Zwittergent 3-16 (закалочной буфер). Элюции из фильтра центрифугированием при 14000 мкг в течение 15 мин. Количественно концентрации пептида в образцах Брэдфорда 19 или BCA анализа 20. Инкубируйте образцы пептида в -80 ° C морозильнике до замороженными (30-60 мин). Высыхание до завершения, при комнатной температуре, в вакуумной концентратором (4-6 ч). Примечание: Сушеные пептиды могут храниться при температуре -20 ° С в течение до трех месяцев. Ресуспендируют триптические белки непосредственно перед Liquid хромато-масс – спектрометрии (ЖХ-МС) анализ в 2% ацетонитрила, 98% H 2 O и 0,1% муравьиной кислоты (подвижная фаза А) до требуемой концентрации. Триптические концентрации пептида от 2,5 мкл плазмы диапазоне от 100 – 300 нг / мкл. 5. Дериватизация N -связанной гликанах с гидрофобными гидразид Теги Развести высушенные тяжелые (ПИП) или света (NAT) P2GPN реагенты в 1 мл 75:25 MeOH: уксусная кислота (дериватизации раствор) для конечной концентрации 0,25 мг / мл. Реагенты будут занимать до 10 минут, чтобы полностью растворять. Обширно вихрь, чтобы обеспечить полное растворение. Примечание: В случае этот протокол дериватизации используется со стандартными N -glycans, по сравнению с очищенными гликанов, молярное отношение P2GPN: Гликан должно быть приблизительно (а не меньше) , чем 17: 1. Тэг сушат N -glycans с 200 мкл (50 мкг) или СИЛ НАТ P2GPN реагента. Пипетировать вверх и вниз для ресуспендирования высушенных гликаны. Vortex саmples, а затем спином вниз образцы для ~ 5 сек на настольном центрифуге. React гликанов с реагентом в течение 3 ч при 56 ° С. Немедленно переместить гликаны из инкубатора к вакуумному концентратору. Высыхание до завершения при температуре 55 ° С (3-5 ч). Примечание: Этот шаг гасит реакцию дериватизации; образец должен быть полностью сухим, чтобы предотвратить перекрестную реактивность на последующих стадиях. Примечание: Сушеные, помеченных пробы могут храниться при температуре -20 ° С в течение до шести месяцев. Ресуспендируют помечено N -glycans в 25-50 мкл H 2 O непосредственно перед анализом LC-MS. Пипетировать вверх и вниз , чтобы обеспечить N -glycans полностью солюбилизированный. Примечание: Объем для ресуспендирования зависит от исходной концентрации гликопротеина, который может быть оценен с исходной концентрации белка. Тем не менее, диапазон будет варьироваться в зависимости от типа образца и должны быть индивидуально оптимизированы. Центрифуга образцов при 14000 мкг в течение 5 мин. Удалите supernatant, стараясь не допустить, чтобы кончик пипетки касаться дна центрифуги трубы. Примечание: Избыточный тег может быть не видна глазу, но будет уменьшен путем центрифугирования. Смешайте пару образцов NAT и Sil, если это необходимо для относительного количественного определения, в соотношении 1: 1 для анализа тандемной. 6. сверхвысокого давления жидкостной хроматографии и масс-спектрометрического анализа Примечание: ЖК и MS условия , описанные для легкого НЖК-1000 и высокочастотного поля Q Exactive, соответственно, были оптимизированы в доме для анализа протеомики и гликановой анализа 21. Эти условия могут быть адаптированы к другим сверхвысоких или нано- к давлению систем LC и других высокотехнологичных средств массовой разрешения мощности спектрометров, но может потребоваться незначительные изменения. Использование высокой разрешающей масс – спектрометрии мощности необходим для гликановой идентификации и анализа деамидированием 22,23. Примечание: Шаги 6.1-6.3 может быть skipped если соответствующий хроматографии с обращенной фазой или гидрофильные взаимодействия коммерческой ловушки и колонки используются. Синтезируя фритты в 100 мкМ ID капилляра в соответствии с Meiring и др. 24 для использования в качестве ловушки. Упаковать ловушку под давлением с 2,6 мкМ, 100 A, C 18 упаковочный материал и нарезают в длину 5 см. Пакет 75 мкМ колонку ID эмиттера под давлением с 2,6 мкМ, 100 A, C 18 упаковочного материала и обрезают до длины 30 см. Подготовьте два различных метода LC-MS для протеомики (6.4.1) и glycomics (6.4.2) рабочих процессов. Примечание: Белок и гликановые образцы могут быть запущены на той же установке ловушки / столбца в любом порядке. Для анализа белков, вводят ~ 400 нг белка на колонку в мобильной фазе А (MPA). Запуск образца при температуре 300 Нл / мин, в соответствии с таблицей 1, с 1 мкл предварительно колонке уравновешивания (500 бар) и 5 мкл аналитической колонке уравновешивания(500 бар). Ионизируют белки в условиях МС , приведенных в таблице 2. Для гликановой анализа, вводят 5 мкл ресуспендировали, P2GPN помечено NAT / ПИП эквимолярные образцов на колонку. Запуск образца при температуре 300 Нл / мин, в соответствии с таблицей 3, с 2 мкл предварительно колонки уравновешивания (500 бар) , и 5 мкл аналитического уравновешивания колонки (500 бар). Ионизируют гликаны при условиях МС , приведенных в таблице 4. Время % MPA % MPB 0 100 0 5 98 2 105 80 20 135 68 32 136 5 95 151 5 95 152 100 0 167 100 0 Таблица 1. Условия LC для протеомики анализа. Градиент элюирования с подвижной фазой B (MPB, 98% ацетонитрила, 2% H 2 O, 0,1% муравьиной кислоты) проводили для вымывания пептидов для дробовика протеомики, зависимым от данных приобретения эксперименты MS. MS 1 Параметры Масс-диапазон (Th) 375-1500 разрешение 120000 AGC 1 × 10 6 Макс Ионизация Время 30 S-объектива FR Уровень 55 Капиллярная TemПК) 300 Спрей напряжение 1,75 MS 2 Параметры Приобретение Тип Top20 разрешение 15000 AGC 1 × 10 5 Макс Ионизация Время 30 Недолив Коэффициент 2% Изоляция окон (Th) 1.4 Заряд Государственный Исключение +1 Нормированная энергии столкновения 27 Время (с) Исключение 20 Таблица 2: MS условия для протеомики анализа Параметры для ионизации электрораспылением, MS 1 приобретение, а также MS 2 приобретение в качестве Orbitrap инструмента с использованием более высокой энергии dissociatio.п (HCD) приведены. Время % MPA % MPB 0 95 5 1 70 30 41 60 40 46 37 63 47 10 90 55 10 90 56 95 5 66 95 5 Таблица 3:. Условия LC для гликановой анализа Градиент элюции проводили для элюирования гидразид меченый N -glycans для анализа MS. <tr> MS 1 Параметры Масс-диапазон (Th) 600-1900 разрешение 60000 AGC 5 × 10 5 Макс Ионизация Время 64 S-объектива FR Уровень 65 Капиллярная Temp (° C) 325 Спрей напряжение 1,75 MS 2 Параметры Приобретение Тип Top12 разрешение 15000 AGC 5 × 10 4 Макс Ионизация Время 100 Недолив Коэффициент 1% Изоляция окон (Th) 1.4 Фиксированный Первая Mass </td> 125 Ступенчатая нормализованной энергии столкновения 10/20/30 Исключение Время (сек) 15 Таблица 4: условия для MS гидразида помечено N -glycan анализ Параметры электрораспылением ионизации, MS 1 приобретение, и приобретение MS 2 в Orbitrap инструмента с использованием более высокой энергии диссоциации (HCD) приведены.. 7. протеомики и Дезамидирование анализ Идентификация белков / пептидов, используя стандартные инструменты поиска биоинформатики. Примечание: Следующий протокол анализа был разработан с использованием баз данных Swiss-Prot / TrEMBL в UniprotKB и поиск с помощью SEQUEST в 1.4 программного обеспечения Протеом Discoverer, однако, протокол может быть непосредственно переведены на любой поисковой белка и скоринга двигателя с использованием программного обеспечения с графическим интерфейсом. Все команды, приведенные ниже, могут быть доступны в программных интерфейсов осуществляется при помощи выпадающего меню. <li> Создать или загрузить организм соответствующую базу данных белковой последовательности из геномных данных или доступных баз данных протеома , как описано Apweiler и др. 25 Примечание: Общие базы данных протеома включают Swiss-Prot, TrEMBL и NCBI, но могут быть построены на основе данных в доме, а также. В программном обеспечении, выберите поисковую базу данных двигателя и выбирать параметры в зависимости от качества полученных данных и требовательности обыска желаемого, как это описано в работе Перкинса и соавт. для MASCOT 26 или Eng и др. для SEQUEST 27. Для получения данных с высокой массовой точности, установить параметры для поиска в программе следующим образом : не более 2 пропущенных расколы, 5 частей на миллион предшественника массовой толерантности и 0,02 Da фрагмент массовой толерантности (для оптимизации обнаружения 22 точным деамидированием) и включают в себя следующие триптические модификации пептидов : "carbamidomethyl (С)" статической модификации и "деамидирование (N / Q)" и "волidation (М) "динамические изменения. При использовании 18 O маркировки пищеварения, включают в себя" деамидирование 18 O (1) " в качестве дополнительной динамической модификации. Поиск, используя выбранный двигатель, необработанные пептидные данные от базы данных белка (7.1.1). Примечание: Массовые допуски должны соответствовать используемого прибора, а не произвольно низким. Примечание: Функция поиска завершается автоматически с помощью программного обеспечения с использованием конкретных различных поисковых системах алгоритмы. Алгоритм перколатор (MASCOT), Sequest или другие комбинации алгоритмов используются для идентификации белков из пептидов и оценка обоснованности обращений; Более подробную информацию о доступных инструментов покрыты в обзоре от Гонсалес-Galarza и др. , 28,29. В зависимости от программного обеспечения, дополнительные параметры поиска, возможно, должны быть выбраны в соответствии с усмотрению пользователя. Экспорт выявленных пептидов для ручной курирование и ФюртАнализ эр. Вручную викарию список пептидов , содержащих определенную дезамидирование на аспарагин из N -связанной гликозилирования мотив (NX – (S / T), где X ≠ P). Перекрестные проверки этих сайтов с известными гликозилирования мотивами из литературы и создать два пула результатов (подтверждено и теоретически). Используйте спектральный отсчет 30 для сравнения процентов размещение данного сайта гликозилирования путем сравнения обилие дезамидированных и не деамидированных форм. 8. Glycan Относительная Количественный Примечание: Следующая идентификация и количественное определение было завершено с использованием программного обеспечения Xcalibur. Тем не менее, любое программное обеспечение, которое анализирует исходные данные и автоматически интегрирует хроматографических пиков могут быть замещены. Генерирование теоретический список гликанов композиций из биологически возможных комбинаций гексоз, дезокси-гексоз, гексозаминов, сиаловой кислоты и другие саccharides. Для этой цели Гликан база данных человеческого была опубликована Walker и др. 15 и может быть использован как есть. Для теоретических баз данных, видоспецифична биологические ограничения должны быть наложены на комбинаторном пространстве, и эти правила описываются Kronewitter и др. 31. Вычислить Гликан моноизотопных массы (м) от атомных масс для каждой композиции для заряда протона состояний + 1-3. Изменение моноизотопном массы включать добавление NAT (254,14191 г / моль) или SIL (260,162042 г / моль) P2GPN тега. Откройте программу "Setup" Обработка с точки зрения дорожной карты в Xcalibur. Установить способ обработки , как в точности описано в Дополнительной материал от Walker и др. 15 с использованием списка , генерируемой на этапе 8.2 , содержащий теоретические моноизотопиче- массы на [М + Н] 1+, [М + 2Н] 2+, и [ М + 3Н] 3+ видов. Примечание: Для подтверждения гликана идентичности за пределами точноймасса, для NAT / СИЛ дуплексной работает, проверьте , что NAT и СИЛ N -glycan пар коэлировать с тем же временем удерживания. Качественно, кросс-проверки идентификации с спектров МС 2, который должен содержать пики , принадлежащие к оксониевого ионов серии 32. Экспорт комплексного, извлекаемого ионного хроматограмм (Xic) областей в Excel для получения содержаний ПИП и NAT , как точно описано в Дополнительной материал от Walker и др. 15 В Excel, программа ячейки в новый столбец для вычисления поправки на вес перекрытия молекулярного путем регулирования численности SIL в соответствии с уравнением , опубликованной Walker и др 1 5.: , где А представляет собой пик одноизотопные и теоретический изотоп перекрытия, , Могут быть независимо друг от друга в расчете на композицию. Во втором столбце, программа клетки , чтобы нормализовать каналы NAT и ПИП с использованием уравнения для полного нормированного гликановой фактора (TGNF), в спектре, как описано Walker и др 1 5.: , где N есть число N -glycans выше предела количественного определения. В новой колонке, программа клетки, чтобы взять отношение СИЛ: NAT гликаны (или наоборот), чтобы вычислить загнутой изменение концентрации между двумя образцами.

Representative Results

Рисунок 1:. Схема клыки-P2GPN гидрофобный мечение в сочетании методом (метод А) для комбинированных протеомики и glycomics анализа дается шаги , которые отличаются между glycomics только для обработки и тандем glycomics и анализа протеомики, с идентификацией сайта гликозилирования, выдвинуты на первый план. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. В линии протеомики и glycomics, фильтр на основе P2GPN гидрофобным метод мечения (метод А) была подтверждена для идентификации, количественного и смещения молекулярной массы с использованием куриных складочный образцов плазмы (рис 1). Для исключительно glycomics экспериментов, интер-сравнения в содержаний N -glycans экстрагируют по методуА до carbograph SPE (золотой стандарт, метод В) были сделаны (рисунок 2). Там не было никаких существенных различий в распространенностях гликанах между этими двумя методами. Внутриизмерительные изменчивость также оценивали путем количественного SIL: НАТ соотношение гликанов, экстрагированных таким же способом. Бревенчатые 2 -распределения обоих методов были гауссовым, с центром на нуле, а не существенно отличается (рис 3А-В). Молекулярная масса колеблется между этими двумя протоколами полностью перекрывается, предполагая , что фильтр не дискриминировать N -glycans на основе диапазона молекулярной массы и гидрофильности (рисунок 4). Рисунок 2: эквимолярной смеси NAT и СИЛ N -glycans экстрагируют по методу А или методу Б получают из 2,5 мкл плазмы курицы (N = 4) Образцы были Anal.yzed по UPLC-МС в соответствии с рекомендуемыми параметрами, предложенными в разделе 6. Содержания для каждого гликана, в каждом канале NAT / Sil, были рассчитаны путем интегрирования площади под извлекаемого ионного хроматограмм (ММА = 3 промилле), с поправкой на молекулярный вес перекрытия и регулировки с помощью TGNF. Эти отношения показаны с их стандартными ошибками. Содержания Метод B: Метод A N -glycans существенно не отличались (р> 0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3: Внутриизмерительные вариабельность в (A) Способ A (N = 133) или (В) Способ Б (N = 123) стратегии сравнивали. NAT и SIL эквимолярные смеси N -glycans, из той же схемы экстракции, Были проанализированы по трем техническим повторах. Бревенчатые 2 -распределений были сосредоточены на нуле и существенно не отличались между двумя рабочими процессами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4: Диапазоны молекулярная масса гликанов из каждой стратегии сравнивались. Две рабочие процессы дали гликаны охватывает тот же диапазон молекулярного веса. N -glycans обнаружен в одном протоколе по сравнению с другой упал чуть выше предела обнаружения (1 × 10 5 изобилие) и не отражают систематическую ошибку. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры. <p class="jove_content" fo:keep-together.в-странице = "1"> Сохранение дегликозилированного белков с помощью фильтра молекулярной массы позволило в линии протеом широкий анализ и сайт гликозилирования идентификации. Множественные протоколы для комбинированной очистки гликанов и белков по сравнению с традиционными препарата ФАСП без дегликозилированием (таблица 5). Наш типичный 18 ч фильтр на основе PNG-азой F переваривание, а затем ФАСП трипсина дайджеста (протокол Std) привело к значительным уровням неспецифической деамидированием, которые могут препятствовать идентификации glycosites. Таким образом, способ, использующий более короткое время инкубации при повышенной температуре (50 ° С) и спайкоподобных на этапе F PNG-азой (протокол SPI), был исследован в качестве альтернативы, наряду с протоколом микроволновой сбраживания (протокол MD), чтобы свести к минимуму не- конкретных деамидирование. Гликанов, наблюдаемые в новых методах пищеварения существенно не отличались в композициях или содержаний от стандартного 18 ч, 37 ° C фильтр F PNG-азой дайджеста ( <strong> Рисунок 5). В сочетании с коротким трипсина инкубации, неспецифический деамидирование была значительно снижена, с ложных срабатываний для glycosites <5% (таблица 5). Белки Пептиды Деамидированная Пептиды Glycosites гликопротеины + – + – + – + – + – ФАСП <td colspan="2"> 249 3083 795 5 5 18hr 217 304 6013 5086 1029 733 257 24 112 18 Мэриленд 270 266 5190 5125 465 455 254 8 102 7 SPI 281 288 4729 4482 602 573 232 10 145 8 . Таблица 5: Сравнение протеомных данных из стандартного трипсином переваривания по сравнению с методом мечения в линию клыков-P2GPN были сделаны Препараты были проведены с (+) и без (-) PNG – азой F , чтобы определить фоновые показатели неспецифической деамидированием и оценки glycosite ложные положительные темпы. Белки были идентифицированы с 1% ложных открытий (FDR); пептиды фильтруются на основе "высокой" пептидной уверенности в Протеом Discoverer 1.4 (д <0,01); glycosites были Опознавательнаяе изд на основе уникальных последовательностей, содержащих деамидированием сохраняющегося гликозилирования мотива (NXS / T); и гликопротеины были определены как идентифицированных белков, содержащих по меньшей мере один идентифицированный glycosite. Рисунок 5: Укороченный протоколы для гликанов были разработаны , чтобы минимизировать дезаминирование в образцах и по сравнению с 18hr клыки F дайджеста PNG – азой. Средние различия в распространенностей составляли 10% и 5% для MD (2.2.3) и (2.2.2) протоколов SPI, соответственно. Из 48 гликанах выявленных, 90% отображается менее чем в 1,5 раза вариации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

High-throughput quantitative methods are needed to facilitate routine glycan analysis. For the last thirty years, glycomics analysis has been limited to a subset of research groups, despite its importance in disease, clinical applications, and pharmaceuticals. The FANGS-P2GPN purification and tagging method for glycomics and proteomics performs the same analysis on a single aliquot of sample, reducing the cost of supplies and the amount of material needed (particularly important in human and mouse studies). Furthermore, efforts to minimize variability in preparations are critically important, as every additional step contributes to error, potentially masking important but low-abundant changes in case-control studies. Coupling of FANGS to hydrophobic hydrazide tagging allows protein and glycan samples to be run on the same RPLC column, enhances glycan ionization, provides for relative quantification, and can be quantitatively applied to plasma.

For N-glycan analysis, it is critical to use the suggested level of PNGase F to achieve full de-glycosylation. Though glycans are solvent exposed, denaturation of proteins and excess enzyme help ensure efficient and complete cleavage. For accurate quantitation of the glycans, it is necessary to ensure that they are completely dried after derivatization to quench the reaction and prevent cross-reactions when mixing the NAT and SIL species. Finally, when extending the workflow to glycosite analysis, timing of the steps is critical to minimize non-specific deamidation. The modified protocols provided for combined glycomics and proteomics analysis work consistently when performed accordingly.

The workflow achieves accurate relative quantitation of N-glycans from plasma compared to the gold-standard, SPE method. There is no apparent bias in the types of glycans extracted in terms of molecular weight, hydrophilicity, and compositional structure. Though we have not explored the qualitative analysis of O-linked glycans, we expect that FANGS could accommodate the addition of a β-elimination step post-PNGase F digestion of N-linked glycans. However, procedures would require significant modification for reagent cleanup prior to mass spectrometry, and peptide analysis will be significantly impacted. For proteomics, the same depth of proteome coverage is achieved compared to traditional FASP methods. Importantly, methods achieve a minimal false discovery rate for N-glycan deamidation. While the method is compatible with ¹⁸O labeling of Asn during the PNGase digestion step^22,23, the low glycosylation site false discovery rate suggests that it may not be necessary, further reducing costs and complexity.

The proteome is not enriched for glycoproteins in this method, which has both advantages and disadvantages. Certain low abundant glycoproteins may not be detected in the analysis. However, the occupancy of glycosylated sites per protein, can be compared between biological samples. Additionally, the error and bias introduced from lectin affinity purification or chemical enrichment is eliminated. In conclusion, coupling of FANGS to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy results in a simplified, quantitative, high-throughput method for the tandem analysis of the glycome and proteome with great potential for application in clinical case-control studies.

Materials

Acetic Acid (50%):	Sigma Aldrich	45754
Acetonitrile, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH015-4
Ammonium Bicarbonate	Sigma Aldrich	A6141
Bradford Reagent	Sigma Aldrich	B6916	Alternative: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C1016
Centrifuge	Eppendorf	5804 R	Alternate centrifuges that reach 14,000 x g are suitable
DL-Dithiothreitol, 1M in solution	Sigma Aldrich	646563
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	Alternate nano or ultra high pressure LCs will produce similar data, such as: 1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC (Thermo Scientific) 2. Acquity UPLC (Waters)
Floating Tube Rack	TedPella	20831-20
Fetuin	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp Standard Lab Ovens	Fisher Scientific	11-690-625F	Alternate incubators that reach 56 °C are suitable
Formic Acid	Sigma Aldrich	56302
GE Microwave Oven	General Electric	57B5 E82904	Any microwave with adjustable power settings is suitable
INLIGHT Glycan Tagging Kit	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	The INLIGHT kit provides NAT and SIL versions of the P2GPN reagent.
Iodoacetamide	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM, 100 Å, C18 bulk stationary phase	Phenomenex	Bulk Media	Alternative: Any C18 stationary phase £ 5 mM
Mascot Daemon Software and Server	Matrix Science		Alternative: Proteome Discoverer Software (Thermo Scientific)
Methanol, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit Self-Pack Column: 360 um, OD 75um ID, 15 um tip, non-coated, 5 per box, 50 cm	New Objective	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F (glycerol-free), 75,000 units/ml	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo Scientific		Alternate high mass accuracy (£ 5 ppm) mass spectrometers will provide similar data
RNase B	New England Biolabs	P7817S
Trypsin from Porcine Pancreas	Sigma Aldrich	T6567-5X
Urea	Sigma Aldrich	51456
Vacuum ConcentratorSavant SPD131DDA SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	SPD131DDA	Alternate vacuum concentrators are suitable
Vivacon 500 30 kDa Filters	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	Alternative: Amicon Ultra 0.5 Centrifugal Filter Units with Ultracel-10 kDa Membrane (Millipore UFC501096)
Water, HPLC grade	Burdick & Jackson	AH365-4
Water, 18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	The addition of 18O in the PNGase F digest step is optional and may not be necessary for deamidation studies completed with 95% confidence
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent Test Kit	Merck Millipore	693030